在線固相萃取-液相色譜串聯質譜法檢測牛奶中14種磺胺類藥物

1在線固相萃取技術檢測藥物的可行性固相萃取（spe）使用固體吸附劑吸收液體樣品中的目標化合物，并將樣品的基質和干擾物質分離，然后用洗滌劑去除，以達到分離和提取目標化合物的目的。樣品中目標物質的分離和富集是色譜分析中必不可少的一部分,因此固相萃取技術作為一種傳統的前處理手段已被廣泛應用于色譜分析的各個領域。常用的固相萃取主要有分散相固相萃取和填料柱固相萃取這兩種方式[1~4],通過這些手段可以達到去除試樣中的干擾物質,使痕量組分得到富集便于檢測和分離,保護色譜分析柱等目的。然而,傳統離線固相萃取常需繁瑣的手工操作才能完成,比色譜分離和數據處理等花費更多的時間。近年來,隨著液相色譜儀技術的迅速發展,儀器的自動化程度越來越高,樣品的前處理技術實現自動化成為了一種新趨勢。在線固相萃取技術傳統填料柱固相萃取和分散相固相萃取相比具有節省人力和耗材,提高前處理穩定性和縮短檢測時間的優勢。磺胺類藥物是具有對氨基苯磺酰胺結構的一類廣譜抗菌藥物的總稱,獸醫臨床和畜牧養殖業中被廣泛應用于預防和治療細菌感染性疾病。但是磺胺藥會引起人過敏性反應,且可能有致癌性,其不合理使用使其在動物性食品中殘留,引起生態環境污染,危害人類健康。針對該情況開發了各類檢測方法,其中較為常見的有酶聯免疫法,HPLC法和UPLC-MS/MS法等。據文獻報道,采用酶聯免疫法快速檢測牛奶中的8種磺胺類藥物,其檢測限可達5μg/L,靈敏度較高,檢測通量大,可以用來做大規模篩查,但無法很好區分磺胺藥物種類;使用高效液相色譜法結合基質固相分散前處理法檢測牛奶中8種磺胺類藥物,其方法靈敏度可達0.05mg/L,但其分析時間較長且靈敏度偏低;有報道超高效液相色譜-串聯質譜法單針進樣可在10min內同時檢測24種磺胺類藥物,其檢測靈敏度高,方法特異性好,但是前處理步驟過于簡單,在檢測大量樣品時容易造成雜質對分析柱和質譜源區的污染。為保障目前市售牛奶的食品質量安全,防止磺胺類抗菌藥在奶牛養殖環節的違法濫用,本實驗采用在線固相萃取結合液質聯用技術檢測牛奶中14種常見磺胺類藥物,利用雙三元液相的程序控制流路切換功能實現了在線固相萃取,解決了牛奶基質中乳脂和蛋白對儀器的干擾和污染;克服了使用傳統固相萃取技術帶來的耗材成本高,人力耗費大等缺點;提高了檢測通量和穩定性,具有更簡捷、經濟和穩定的特點。2實驗部分2.1高速冷凍離心系統n-evapUltiMate3000雙三元超高效液相色譜,變色龍色譜控制軟件,TSQQuantiva串聯四級桿質譜帶HESI電離噴霧源,Xcalibur數據處理系統,RetainCX陽離子交換在線SPE柱(3.0mm×2.1mm),HypersilgoldC18分析柱(100mm×3.0mm3.0μm),以上均為美國ThermoFisher公司產品。AllegraX-22R高速冷凍離心機(美國BeckmanCoulter公司);N-EVAP水浴控溫氮吹儀(Anpel公司)。磺胺醋酰(Sulfacetamide,STD)、磺胺吡啶(Sulfapyridine,SPD)、磺胺嘧啶(Sulfadiazine,SDZ)、磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole,SMZ)、磺胺噻唑(Sulfathiazole,ST)、磺胺甲嘧啶(Sulfamerazine,SMR)、磺胺曲沙唑(Sulfatroxazole,STX)、磺胺甲噻唑(Sulfamethizole,STZ)、磺胺苯甲酰(Sulfabenzamide,SBZ)、磺胺二甲基嘧啶(Sulfadimidine,SDMD)、磺胺甲氧噠嗪(Sulfamethoxypyridine,SMPD)、磺胺氯噠嗪(Sulfachloropyridazine,SCP)、磺胺二甲氧嘧啶(Sulfadimethoxine,SDM)、磺胺苯吡唑(Sulfaphenazole,SP),純度均大于≥99.0%(德國DrEhrenstoferGmbH公司);氨水(分析純,上海振興化工廠);甲醇、乙腈、甲酸(色譜純,德國Merk公司);去離子水(自制,電阻率≥18MΩcm);高純氮、高純氬(99.999%,上海佳杰特種氣體公司)。2.2實驗方法2.2.1離心條件的制備準確稱取搖勻后牛乳5.00g(精確至0.01g),置于50mL離心管中,加入15mL乙腈,具塞振蕩30s,搖勻后,8000r/min離心3min;取上清液至另一個50mL離心管中,50℃氮氣吹干后,加入1.00mL0.2%甲酸溶液充分溶解,過0.22μmPTFE濾膜,準備上機凈化測定。2.2.2色譜-質譜條件在線富集凈化色譜柱為RetainCX(20mm×3.0mm),進樣流路使用20μL溶劑混合器,流動相A為5%氨水-甲醇溶液,B為甲醇,C為0.2%甲酸溶液。分析色譜柱使用HypersilgoldC18(100mm×3.0mm,3.0μm),分析流路使用200μL溶劑混合器,流動相:A為5%氨水-甲醇溶液,B為乙腈,C為0.2%甲酸溶液。進樣量10μL,柱溫30℃,進樣流路流動相比例切換采用六位切換閥進行瞬變切換,分析流路流動相比例采用勻速梯度變化,梯度程序見表1,切換閥流路裝配見圖1。2.2.3定性離子檢測質譜檢測器為ThermoFisher公司的TSQQuantiva串聯四級桿質譜帶HESI電離噴霧源,選擇正離子模式,源電壓為3500kV,鞘氣(Sheathgas)壓力344kPa,輔助氣(Auxgas)流速5L/min,吹掃氣(Sweepgas)流速0.3L/min,離子傳輸管(Iontransfertube)溫度350℃,霧化器(Vapourizer)溫度400℃,離子透鏡(RSLens)電壓為70V,檢測模式為選擇反應監控(Selectedreactionmonitoring,SRM),碰撞氣壓力0.2Pa,Q1段分辨率設為半峰寬0.4,Q2段分辨率設為半峰寬0.7,14種磺胺類藥物的定性與定量離子對以及對應的撞擊能量見表2。2.2.4標準曲線進樣范圍將14種磺胺類藥物對照品分別用甲醇溶解,制成1mg/L的標準品貯備液,取適量該貯備液,用0.2%甲酸-乙睛(15∶85,V/V)稀釋成0.5,1.0,2.0,5.0,10.0和50.0μg/L的標準曲線系列工作溶液,將此系列溶液依次按2.2.2和2.2.3節的方法進樣檢測,所得定量通道色譜圖積分后面積以A表示,進樣濃度以C表示,回歸曲線見表3,其線性相關系數r≥0.999,證明本方法在0.5~50μg/L的進樣濃度范圍內線性良好,其對應的檢測方法檢測含量范圍為0.1~10μg/kg。3結果與討論3.1源電壓的選擇通過蠕動泵以10μL/min的速度向質譜儀中注入含有1mg/L14種磺胺類化合物的混合標準工作液。將鞘氣壓力設為34kPa,輔助氣流速設為0.3L/min,吹掃氣設為0,在2000~4500kV范圍內依次以100kV增加源電壓,并檢測目標化合物的[M+H]+分子離子峰絕對響應。實驗表明,當源電壓設為3500kV時,大部分磺胺類化合物的[M+H]+分子離子峰絕對響應達到最大值;之后,隨著源電壓上升,響應沒有顯著增加;到3800kV之后甚至有下降趨勢,且源區有微弱電弧光顯現。推測可能是電壓太高而造成霧化后的微液滴電荷過載,發生擊穿放電現象,此現象導致進入離子傳輸通道的帶電粒子數下降。因此,源電壓選擇3500kV。另外,在被檢測的化合物中,SPD與SDZ分子離子的質荷比僅差1,SMZ與ST之間,SBZ與SDMD與SMPD之間的質荷比僅差2,因此有必要提高Q1段的質量數分辨率,避免相互之間的干擾。將Q1段的質量數分辨率從原來的半峰寬0.7提高到0.4,這樣可能會損失一定的響應值,但是可以很好地解決質量數接近的分子離子互相干擾問題,有效提高信噪比。3.2色譜質譜條件的選擇在線固相萃取(OnlineSPE)是通過控制兩臺獨立工作的液體傳輸泵和切換閥使用程序分別進行檢品的富集凈化和分析,需要有一臺泵負責進樣和富集凈化功能,使目標化合物在在線固相萃取柱上實現保留富集和洗滌;通過閥切換,使用另一臺泵進行樣品的過柱分離和檢測。選擇合適的在線固相萃取柱和設計合理的富集凈化和洗脫條件是在線固相萃取方法的關鍵,本方法選擇RetainCX作為在線SPE柱,RetainCX的富集凈化機理為陽離子交換結合反相機理,磺胺類藥物大多為堿性化合物,使用陽離子交換結合反相模式的在線固相萃取柱具有更好的富集凈化效果。在進樣時進樣泵的流路采用甲醇-0.2%甲酸(10∶90,V/V)為流動相,可在富集磺胺類藥物的同時清洗部分極性較大的雜質,通過在線分析柱后直接連接質譜檢測器,發現采用此流動相并無目標化合物的流失(圖2a)。選擇5%氨水-甲醇溶液作為洗脫液,通過閥切換,使用分析流路進行洗脫和分析,分析流路應在閥切換之前先用洗脫溶液充滿流路,這將有助于更快地在閥切換之后集中將目標化合物洗脫,避免因為分析流動相造成在線凈化柱上目標化合物的擴散而造成目標峰展寬。將流路中的分析柱拆去,用兩通替代,可以獲得目標化合物的洗脫時間約為4.2min(圖2b)。據此可以確定,閥切換的時間應該略晚于此時間,但不應過長而導致部分低極性雜質進入分析流路。由于5%氨水-甲醇洗脫劑和0.2%甲酸-乙睛(15∶85,V/V)分析流動相的差異較大,容易由于溶劑化效應而造成色譜峰展寬,因此洗脫時采用較低的流速0.4mL/min,減小進樣溶劑的總量;此時分析流路使用較高流速0.8mL/min,并將洗脫劑中5%氨水-甲醇比例下降至70%,有效消除了溶劑化效應(圖2c)。3.3方法的檢出限和定量下限選擇20個空白樣品,按優化條件進行處理后上機測定,取與標準品圖譜中相同保留時間的噪音信號平均值,以信噪比S/N≥3為檢出限(LOD),S/N≥10為定量下限(LOQ),確定該方法對鹽酸賽庚啶的檢出限為0.05μg/kg,定量下限為0.1μg/kg。經過實際進樣檢測后,檢測定量限附近峰型良好。3.4固相萃取法優化磺胺類化合物為研究在線固相萃取和傳統固相萃取法檢測牛奶種14種磺胺類藥物時方法回收率和