TLR4在腦出血繼發性損傷中腦水腫形成的炎性機制研究

一、實驗背景及意義

二、實驗研究內容

三、實驗方法及技術

四、實驗可行性分析

五、實驗預期結果

六、實驗進展

七、實驗經費預算

八、參考文獻實驗背景及意義腦出血后繼發性損傷腦水腫形成是多種機制的綜合結果，其中炎性損傷機制備受矚目[3,4]，各種炎性細胞的激活，細胞因子、炎性遞質的釋放，共同造成或加重繼發性腦損傷[5]。研究說明炎性反響與腦水腫有著密切聯系：炎性反響是腦水腫形成的重要原因[6,7]。目前在炎癥免疫反響的研究領域里，Toll樣受體家族〔Toll-likeReceptors,TLRs〕是眾多學者的關注熱點，其屬于跨膜信號轉導受體家族，通過感知病原微生物存在，轉導細胞的炎性信號，參與多細胞生命體古老的防御機制，是連接先天免疫和特異性免疫的紐帶。TLR4參與腦缺血再灌注損傷已被實驗所證[16,17,18]，TLR4激活炎性反響是缺血性卒中后腦水腫形成的重要環節。Cao等[16]采用大鼠大腦中動脈線栓模型,研究發現腦缺血6h再灌注24h后,無論是腦水腫程度、腦梗死體積,還是神經元損傷程度,TLR4缺陷的小鼠都明顯低于野生型,并且TNF-α和IL-6水平降低,認為腦缺血再灌注后TLR4缺陷的小鼠可能通過抑制炎性細胞的激活,下調炎性細胞因子的產生來減少炎癥反響,從而減輕損傷程度。其實腦出血后血腫周圍也存在缺血現象[19]，出血性卒中與缺血性卒中的損傷機制在某種程度上有著共性。但TLR4是否參與腦出血后繼發性損傷,是否通過介導炎性機制在腦水腫形成的病理生理演變過程中發揮作用,至今尚不清楚。水通道蛋白4(Aquaporin4,AQP4)是焦點，作為一種與水通透有關的細胞膜轉運蛋白，影響水跨膜轉運和調節細胞內外環境平衡。在正常腦組織中主要分布于鄰近毛細血管壁的星形膠質細胞足突上和腦室周圍的室管膜細胞，成為水在細胞、血管和腦室移動的關鍵部位[20]。星形膠質細胞瘤中AQP4表達明顯上調,并與腦水腫程度、血腦屏障的開放有顯著的相關性[21]。多種腦水腫實驗模型均顯示AQP4在腦水腫的發生開展中扮演重要角色[22，23]。實驗說明：炎性反響可上調AQP4的表達。在過敏原和IL-13誘導的哮喘小鼠模型中[24],炎性反響顯著，基底膜側的AQP4表達上調是特征性的改變。AQP4在實驗性自身免疫腦脊髓炎模型的腦皮質和脊髓中表達也上調[25],提示AQP4可能與急性期炎癥的開展相關。張新宇等[26]通過在大鼠腦內微量注射炎性因子TNF-α后，發現早期就可出現腦水腫，并測得AQP4明顯上調、血腦屏障通透性顯著增加，且二者成顯著正相關。因此，炎性因子誘發腦水腫的機制可能是：通過多種途徑破壞血腦屏障，繼而誘導AQP4表達上調，進一步加重腦水腫，形成惡性循環。進而推測：TLR4作為炎性信號通路轉導受體，激活下游強有力的炎性級聯反響，介導炎性損傷,極有可能也通過誘導AQP4表達上調,參與腦水腫形成。但目前，國內外缺乏此方面的研究。實驗研究內容本課題采用大鼠尾狀核立體定向注射自體血模型，研究TLR4是否通過介導炎性反響，上調AQP4表達參與腦出血后腦水腫形成，探索TLR4在腦出血繼發性損傷中腦水腫形成的炎性機制。具體內容：1、從基因分子水平，研究時間演變過程中TLR4mRNA、TNF-αmRNA表達與AQP4mRNA表達、腦出血后腦水腫程度的相關性。2、并與蛋白、細胞水平結合，研究腦出血損傷后TLR4、TNF-α與AQP4在時空上的變化及聯系。實驗方法1、實驗動物及分組實驗一：65只SD大鼠將其隨機分為手術組(A1組，n=30)、假手術組(B1組，n=30)、空白對照組(C1組，n=5)。A1組和B1組按手術后處死的時間再分為1h組、6h組、24h組、72h組，5d組，7d組，每組各為5只。在相應的時間點處死大鼠后測量大鼠腦的含水量、腦組織TLR4mRNA、TNF-αmRNA、AQP4mRNA的表達測定。實驗技術2腦組織標本的采取:實驗一：在各時間點將大鼠麻醉后斷頭取腦，以腦血腫處為界，將腦組織分為前半部、后半局部。前半部用于腦含水量的測定；后半部用于TLR4mRNA、TNF-αmRNA、AQP4mRNA的測定。實驗二：術后在相應時間點乙醚麻醉動物,從左心室插管至主動根部，生理鹽水快速灌注之后，多聚甲醛快速灌注固定，斷頭取腦,以注射針道為中心做冠狀切片,厚度約5mm.標本按常規程序制成厚度5μm的石蠟切片。相鄰切片分別行HE染色病理觀察、及TLR4、TNF-α、AQP4免疫組化檢測實驗技術3腦含水量的測定：取每只大鼠右側大腦半球穿刺點前半部的腦組織分別稱重(濕重)，然后置入100℃恒溫烤箱中，24h后取出再稱重(干重)。以(濕重－干重)／濕重×100％計算腦含水量，以此代表腦水腫的程度。實驗技術4免疫組化法檢測冠狀腦切片TLR4、TNF-α、AQP4蛋白水平及對腦組織行RT-PCR分析TLR4、TNF-α、AQP4。實驗可行性分析〔一〕承擔單位概況(人員、資產、業務與管理狀況)在相關國內外研究的根本動態和技術的根底上，我們具有一批能夠參與該方面研究的人員。本課題組成員對相關學科的實驗技術熟練，實驗方法可靠，可重復性強，并已進行一些前期的研究，取得了初步經驗。另外，申報單位具有國家重點實驗室的平臺，其實驗設備與技術完全能滿足該工程的需要。因此，探索腦出血繼發性損傷機制，尋找炎性信號轉導治療靶點，我們認為從研究人員，到研究技術和研究條件都具有可行性。實驗可行性分析〔二〕本工程現有的研究工作根底(包括現有科研裝備條件)我院呼吸疾病國家重點實驗室已具備了動物造模、RT-PCR、免疫組化等實驗技術的所需設備：動物頭顱立體定位儀(SN-2,NARISHIGE，日本)、電子分析天平(BP211D，塞多利斯，德國)、PCR熱循環儀〔日本Techne公司〕、全自動紫外分光光度儀〔美國PerkinElmer公司〕、電泳凝膠圖像分析儀〔上海Tanon公司〕、高速低溫離心機〔德國Universal公司〕、電泳儀(PowerPacBasic,BIO一RAD，美國)、石蠟切片機(德國LeicaRM-2135)、光學顯微鏡(日本Olympus)、顯微鏡攝像系統(日本Olympus)等。該國家重點實驗室及我院病理科可為實驗提供有力的技術支持。實驗預期結果1腦出血后TLR4作為炎性信號通路轉導受體，激活下游強有力的炎性級聯反響，通過誘導AQP4表達上調,參與腦水腫形成。2TNF-α通過誘導AQP4表達上調，參與腦出血后腦水腫的形成。實驗進展起止時間主要工作內容2021年10月-2021年12月實驗前期準備，定購試劑、耗材、大鼠，預實驗。2021年1月-2021年3月完成實驗一：手術造模、依各時間點腦組織取材，測定腦含水量、RT-PCR方法測定TLR4mRNA、TNF-αmRNA、AQP4mRNA的表達。2021年4月-2021年6月完成實驗二：手術造模、依各時間點腦組織取材，冠狀腦切片行HE染色病理觀察，免疫組化法檢測TLR4、TNF-α、AQP4蛋白。2021年6月-2021年7月整理數據，統計分析。2021年7月-2021年10月撰寫論文、投稿。實驗經費預算1、專用業務費：1〕標本、樣品采集加工費：5000元2〕測試費：6500元3〕試驗動物養殖費：250×2×7=3500元4〕其他〔管理費、協作費、勞務費、論文版面費〕：5000元2、原材料費：1〕RT-PCR試劑〔Trizol、DEPC、DNaseⅠ、逆轉錄試劑盒、微量加樣槍、TLR4、TNF-α、AQP4及內