豬、雞及乳制品中乳酸菌的分離及耐膽鹽性能研究

蘑菇是動物身體的正常生理菌之一。如果在腸道內繁殖達到一定數量，它將改善和調節主體內微生物菌群的平衡，對主衛生起到有益的作用。ch。促進動物對營養物質吸收、增強動物機體免疫力、抑制有害細菌生長等作用［２］。乳酸菌不但賦予發酵食品特有的風味,還具有一定的益生功能。Metchnikoff在1908年首次提出攝食發酵食品對人體具有保健功能,而發酵食品的保健功能得益于其中的微生物,現已明確發酵食品中的乳酸菌對人體具有多種保健功能,如提高機體免疫力［３］。乳酸菌等益生菌能否發揮作用,取決于菌株能否通過胃腸道的酸性環境以活菌的狀態到達小腸,從而發揮微生態的益生功能［４］。因此,篩選能夠進入腸道、具有高生存性的乳酸菌,是益生菌開發首要考慮的問題。內蒙古作為我國的傳統牧區,乳制品是當地牧民的主要食物來源。傳統的乳制品加工方法經過數百年的優化,篩選,較好地保存了當地自然環境中的有益乳酸菌,是天然的乳酸菌貯存庫［５］。本試驗從內蒙古阿拉善牧戶家中采集的酸奶及酸駝乳樣品以及呼和浩特某養豬廠和養雞場成功地分離了30株乳酸菌,獲得了6株具有耐酸和耐膽鹽的高生存性乳酸菌(菌株分離采用厭氧培養法),并對這6株菌的耐酸以及耐膽鹽特性進行了詳細的分析。1材料和方法1.1培養基mrs1.1.1樣品來源傳統乳制品(酸奶和酸駝乳):阿拉善牧區(隨機采集,采集后4℃保藏備用)。豬:呼和浩特市賽罕區快活林養豬場(隨機抓取豬,然后取其腸內容物分離目的菌株)。雞:前不塔氣村養雞場(隨機抓取雞,然后取其腸內容物分離目的菌株)。1.1.2培養基MRS液體和固體培養基。1.1.3主要試劑牛膽鹽3號(BD),Becton,Dick-insonandCompany;豬膽鹽,廣東環凱微生物科技有限公司050110。1.2菌株的活化與培養1.2.1菌株的分離純化將采集到的樣品做10×稀釋,選取合適的稀釋度涂布MRS平板,37℃厭氧培養48h,挑取單個可疑菌落進行涂片、革蘭染色、鏡檢,選擇G＋菌且無芽胞的菌株,繼續在MRS［６］平板上反復劃線純化,液體培養,將菌液與滅菌甘油按1∶1混合置于-20℃冰箱進行菌種保藏。1.2.2菌株的耐酸性試驗1.2.2.1將甘油保護劑中保存的菌株在MRS液體培養基中連續活化3代。1.2.2.2活化好的菌液在4000r/min離心25min,棄去上清液,沉淀菌體用滅菌MRS液體培養基洗滌3次,將菌體重懸于此培養基中并調整菌懸液濃度為3.0×10８cfu/mL。1.2.2.3用濃度為1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH將菌液的pH調整為2和3兩個試驗梯度,放入37℃恒溫培養箱中,2h后取出,立即做梯度稀釋,選取合適的稀釋度吸取1mL稀釋液涂布MRS平板,37℃培養48h后計數菌落,記錄結果并計算其存活率,做3個平行試驗求平均值［７］。同時用放置0h的菌液作為對照。1.2.3菌株的耐膽鹽試驗取上述1.2.2中制備的菌懸液分組,分別加入1.0、2.0、3.0g/L的豬膽鹽和牛膽鹽,放入37℃恒溫培養箱中3h取出,立即做梯度稀釋,選取合適的稀釋度吸取1mL稀釋液涂布MRS平板,37℃培養48h后菌落計數。存活率計算公式同上。2結果2.1分離菌種比例2.1.1菌株分離鑒定結果試驗結果初步表明,分離到的30株均為乳酸菌(表1)。由表1可知,乳桿菌共18株,占所分離菌株的60%;乳球菌共12株,占所分離菌株的40%。2.1.2經過初篩得到的6株乳酸菌分別命名為LS、LZ1、LT、LJ1、LZ2、LJ2,其菌落特征及菌體形態見表2。2.2u3000ls和lj2的存活率經耐酸試驗,分離到的6株乳酸菌對pH2.0和pH3.0的不同生長環境表現出不同程度的耐受性。有2株菌在pH2.0環境下存活率高達135%和124%,分別是LS和LJ2,它們在pH3.0條件下也具有較高存活率;LZ1和LT在pH2.0條件下存活率較低,僅為23%和19%,而LZ1在pH3.0時存活率可達137%;其余菌株的存活率從43%~82%不等,結果見表3。2.3菌株的生存率及致病結果2.3.1不同濃度豬膽鹽中菌株耐受結果不同濃度豬膽鹽中菌株耐受結果如表4。在豬膽鹽濃度為1.0g/L時各株菌的生存率變化很大,從最低的49%到最高的132%之間;當膽鹽濃度為2.0g/L時,各株菌的生存率較1.0g/L時有所降低,平均為59%;當膽鹽濃度達到3.0g/L時,存活率明顯降低,平均為45%。其中LJ1在各濃度膽鹽中的存活率都達到了60%以上,在3.0g/L時高達69%,最為穩定。2.3.2不同濃度牛膽鹽中菌株耐受結果不同濃度牛膽鹽中菌株耐受結果見表5。本試驗中的6株菌在不同濃度的牛膽鹽中也有不同程度的存活率,其中LT菌株在各濃度條件下都表現出較高的存活率,分別為100%、89%、99%,其他各菌株的耐受能力隨著膽鹽濃度的提高而降低。3菌株在膽鹽中的生長特性乳酸菌具有調節腸道菌群、增強機體免疫力等益生作用［８－１０］。而乳酸菌能夠充分發揮益生作用的前提是可以大量、有活性地通過家畜胃腸道,家畜胃腸道微生物眾多,胃酸、膽汁構成了一道天然屏障,只有那些高活性的乳酸菌能夠耐受這樣的內環境,所以本實驗的主要目的是鑒定分離到的乳酸菌是否具有高的生存性。動物肝臟分泌到十二指腸中的高濃度的膽酸鹽具有抗菌活性,它對細胞膜有很強的破壞能力,其疏水作用能使乳酸菌細胞膜膜脂溶解,導致膜蛋白離解和細胞膜破裂。本試驗分離株LJ1在豬膽鹽中表現較高存活率,高達132%,而在牛膽鹽中分離株LT存活率達到100%。由此可以看出,不同菌株在不同的膽鹽培養基中的存活率有較大差異。對哺乳仔豬而言,其膽囊內膽汁量很少,在出生后3周內膽汁量增加緩慢［１１］,一般在0.3g/L~3.0g/L范圍內波動,本試驗所用試驗豬均非哺乳仔豬,膽汁生成量充足,可以促進大量乳酸菌細胞膜的破裂,從而表現較高的生存活性,因此對豬膽鹽表現出較高的耐受能力。同時,膽鹽能在動物小腸形成高滲透壓環境,而多數動物腸道膽鹽濃度范圍為0.3g/L~3.0g/L。［１２］所以本試驗選擇膽鹽濃度范圍在1.0g/L~3.0g/L。ChouLS等［１３］研究發現用膽鹽選擇性馴化乳桿菌的膽鹽耐受性是有效的,經過幾代膽鹽馴化后得到的乳桿菌耐膽鹽的能力比親代乳桿菌強,而本實驗結果得到的乳酸菌LJ1和LT未經過不同酸度、不同膽鹽濃度的培養基馴化,就有較強的耐酸和膽鹽耐受性,這一結果與這些菌株的特殊生存環境有密切關系,即當地酸度比較高的發酵奶,而且此類發酵乳制品的發酵劑也是已發酵的駝奶,他們不做酸駝奶時,低溫保存已發酵的酸駝奶,這種制作工藝恰恰給其里面的乳酸菌賜予自然馴化的生存環境,因此這些乳酸菌具有一定的耐受性。這些菌株在進一步確定其它益生能力后