高效液相色譜-串聯四極桿質譜法測定嬰幼兒配方乳粉中多殘留

黃曲霉素p1是由于動物攝入黃曲霉素b1，并在體內形成羥基化形成的代謝產物。1963年Alleroft首先發現,直到1965年才命名為AFM1,它是一種強致癌物質,毒性僅次于AFB1,WHO將其列為ⅡB類致癌物。AFM1主要存在于動物的乳、腎臟、肝臟、蛋、肉和尿中,其中以乳中最為常見。氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪和苯甲酸雌二醇因其較大的毒副作用,成為農業部發布《動物性食品中獸藥最高殘留限量》(農業部235號公告)中不得檢出的藥物。當前,我國食品安全形勢依然嚴峻,2008年發生的乳粉中三聚氰胺重大食品安全事件充分顯示,必須提高對嬰幼兒食品中危害因素的監測、評估能力和預警水平。衛生部指出,要力圖避免因監管手段缺失發生新的嬰幼兒食品安全隱患。因此,尋求準確、快速、靈敏度高的檢測方法,對嬰幼兒食品中多種常見有毒及禁用物質進行高通量的定性定量分析,是食品安全研究的一個重要方面。由于目前還沒有嬰幼兒配方乳粉中氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪和苯甲酸雌二醇多殘留的國家標準檢測方法,還不能完成科學監管,保護廣大嬰幼兒的健康和利益。因此,及時尋求簡便、快速、準確、敏感性高的嬰幼兒配方乳粉中氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1和苯甲酸雌二醇殘留的檢測方法才能保障食用嬰幼兒配方乳粉的衛生和安全。目前,測定氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1和苯甲酸雌二醇殘留的文獻比較多,方法主要是酶聯免疫法、高效液相色譜法和液相-質聯用法等。酶聯免疫法不能定性,存在假陽性等情況;液相色譜法雖然對儀器要求不高,但檢出限不高,而且不能滿足確證要求;液相色譜-質譜聯用技術是近年來新興的檢測技術,由于其準確、高效和高靈敏度,符合目前食品安全檢測所追求的快速高效的要求。目前還未見液相色譜-串聯質譜聯用法用于同時檢測氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1和苯甲酸雌二醇的報道。本文采用堿性乙腈提取目標物,采用高效液相色譜串聯質譜儀進行檢測,前處理簡單,靈敏度高,適合于嬰幼兒配方乳粉中氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1和苯甲酸雌二醇殘留的同時快速檢測。1實驗部分1.1方法和儀器甲醇、乙腈:色譜純,德國Fisher公司;氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1、苯甲酸雌二醇:w≥99%,美國Sigma公司;實驗所選用樣品為作者單位檢驗樣品;其他試劑均為國產分析純。Agilent6410型串聯三重四極桿質譜儀:配Agilent1200型液相色譜儀,美國Agilent公司;RE-2000型旋轉蒸發器:上海市亞榮生化儀器廠;KQ-5200型超聲波清洗儀:昆山市超聲儀器有限公司;TGL-16M型高速臺式冷凍離心機:湘儀離心機儀器有限公司;Milli-Q去離子水發生器:美國Milli-Q公司。1.2標準溶液的配制標準儲備液:分別稱取適量的氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1和苯甲酸雌二醇標準品,分別用甲醇配成0.1mg/mL的標準儲備液,該溶液在-18℃保存。標準工作溶液:用甲醇將標準儲備液稀釋成1.0μg/mL。空白樣品提取液:選擇陰性樣品,按1.5操作。基質混合標準工作溶液:根據儀器的靈敏度和線性范圍,吸取一定量的標準工作溶液,用空白樣品提取液配成系列濃度的基質混合標準工作溶液。1.3流動相in色譜柱:資生堂MGⅢ-C18柱,1.8μm,2.1mm×150mm。條件:流速0.25mL/min,柱溫25℃,進樣量20μL,流動相:甲醇(A)+10mmol/L乙酸銨緩沖溶液(B);梯度洗脫:0~3min,B保持80%,3~15min,B由80%線性遞減至5%,15~21min,B保持5%,21.0~21.1min,B由5%線性遞增至80%,21.1~25.0min,B保持80%。1.4干燥氣離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:正離子掃描;檢測方式:多反應檢測;干燥氣:N2;霧化氣壓力:275.8kPa;干燥氣溫度:325℃;干燥氣流速:8L/min;汽化溫度:340℃。1.5乙腈溶液的定容稱取4.0g樣品,精確至0.01g,置于100mL比色管中,加水35mL,充分溶解后超聲提取5min,再用含1%氨水的乙腈溶液定容。超聲波提取20min,上清液經濾紙過濾,吸取25mL濾液至100mL蒸發瓶內,并將其接至旋轉器上,于45℃水浴中減壓蒸餾至1mL,加含2%氨水的甲醇溶液充分溶解后定容至5mL,濾紙過濾后待測(如渾濁嚴重,以8000r/min高速離心10min,取上清液過濾膜)。2結果與討論2.1樣品提取溶劑的選擇為了充分提取樣品中氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1和苯甲酸雌二醇殘留,本實驗首先分別選擇乙腈、甲醇、乙酸乙酯等做為樣品提取溶液,實驗結果均不理想。隨后經過反復實驗,發現含1%氨水的乙腈能有效地提取樣品中目標化合物,同時能有效除去樣品中的蛋白質,因此,選擇此溶液作為樣品提取液。此外,實驗還發現,只有當定容溶液為堿性時,才能充分溶解目標化合物,所以本方法選擇含2%氨水的甲醇溶液作為樣品的定容溶液。2.2色譜柱及流動相的選擇色譜柱的選擇:為了有利于色譜峰的分離及峰形的改善,本方法分別采用資生堂MGⅢ-C18色譜柱(150mm×2.1mm,1.8μm)、ZORBAXEclipseXDB-C18色譜柱和ZORBAXSB-Aq色譜柱(150mm×2.1mm,3.5μm)進行分離實驗,發現資生堂MGⅢ-C18色譜柱(150mm×2.1mm,1.8μm)效果較好。流動相的選擇:實驗發現用水作水相流動相時,雙酚A色譜峰易展寬,因此本方法采用10mmol/L乙酸銨溶液-甲醇為流動相,利用梯度洗脫的方法提高分離及檢測效果。測試開始時,流動相中10mmol/L乙酸銨溶液-甲醇的比例為80:20,然后在0~3min保持此比例,這一部分主要是洗脫測定液中極性較強的雜質;3~15min內將改變二者的比例為5:95,這一部分主要是洗脫測定液中的中等極性雜質;15~21min保持此比例,這一部分主要是洗脫測定液中氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1和苯甲酸雌二醇。通過上述兩步梯度,在25min內,可以較好地分離測定液中氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1和苯甲酸雌二醇(結果見圖1)。2.3質譜條件確定采用直接進樣方式將濃度為100ng/mL的氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1和苯甲酸雌二醇注入離子源中,在正離子檢測方式下進行母離子全掃描,得到氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1和苯甲酸雌二醇的分子離子峰。根據歐盟2002/657/EC指令規定對于質譜確證方法必須達到4個確證點的要求,低分辨液相色譜-質譜聯用儀檢測應在確定母離子的基礎上選擇2個以上的子離子。以該離子峰為母離子,進行二級質譜掃描,最后采集全掃描的二級質譜圖,得到碎片離子信息,然后再對得到的二級質譜參數如破碎電壓、碰撞能量等進行優化,使定性離子與定量離子產生的離子對強度比例達到最大時為最佳。得到氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1和苯甲酸雌二醇的最佳質譜參數(結果見表1)。2.4標準曲線和檢出限用空白樣品提取溶液逐級稀釋的標準工作液,分別進樣20μL,測定結果經線性回歸(y為峰面積,Counts;x為濃度,μg/L),同時用空白樣品進行加標實驗,在信噪比均大于3的條件下能檢出,將此添加量定為檢出限。結果見表2。2.5加標回收率試驗每組準確稱取空白樣品6份,每份4.0g,共3組,分別定量加入目標標準物質,第一組添加水平:醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1均為0.5μg/kg,苯甲酸雌二醇、氯丙嗪均為5.0μg/kg;第二組添加水平:醋酸甲孕酮、塞拉嗪、黃曲霉毒素M1均為5μg/kg,苯甲酸雌二醇、氯丙嗪均為25.0μg/kg;第三組添加水平:醋酸甲孕酮、黃曲霉毒素M1均為25μg/kg,氯丙嗪、塞拉嗪、苯甲酸雌二醇均為250.0μg/kg。按供試品溶液制備方法制備后進行測定,結果見表3。從表3中可看出,不同濃度平均加標回收率76.7%~102.1%,平