柑桔潰瘍病拮抗細菌的篩選與鑒定

柑橘潰瘍是由地中海草黃單胞菌的小麥菌引起的。目前，對該病的病因、發生規律、化學防治等方面的研究取得了一些進展。國外有人對該病進行了預防性研究，但中國很少有這方面的報告。作者在柑橘潰瘍區的多個品種的柑橘葉片和幼果中進行了微生物分離、室內篩選、溫室和田地效應的抗逆性試驗，篩選有效的抗逆性，為柑橘潰瘍找到有效的防治和抗病性提供基礎。1材料和方法1.1病例對照調查1999年從湖南衡山農科所采集具有潰瘍病斑的新鮮甜橙病葉,香柚、甜橙、臍橙、紅橙春梢健康葉片;江永縣農科所采集的香柚、夏橙、蜜桔夏梢健康葉片及幼果;南岳園藝場采集的香柚、臍橙、夏橙、蜜桔春、夏梢健康葉片及幼果.1.2k-2和k-18菌的抗菌藥活性測定1)病原菌的分離與拮抗菌株的篩選.采用平板稀釋分離法分離有病斑的新鮮甜橙病葉的病原菌.健康春、夏梢柑桔葉片與幼果表面拮抗微生物菌株的分離方法為:每支試管裝1片葉或1個幼果,加入4mL滅菌水,搖動10min.然后每管各取1mL含菌水溶液進行平板稀釋分離,用分離到的菌株進行柑桔潰瘍病菌平板拮抗測定,篩選出具有拮抗作用的菌株.2)拮抗菌株生物學特性初步測定.28℃在牛肉膏蛋白胨平板培養基上培養48h,觀察菌落形狀及革蘭氏染色結果.3)拮抗菌株生長的最適pH值測定.K-2,K-18在pH值分別為6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5的牛肉膏蛋白胨培養液中,30℃80r/min振蕩培養48h,用721型分光光度計測定培養液在波長為620nm處的吸光值.設3次重復,結果取平均值.4)K-2,K-18的無菌濾液對柑桔潰瘍病菌的拮抗效果測定.用孔徑為25nm的細菌過濾器過濾已培養24h的K-2,K-18新鮮懸浮液,以無菌水為對照,用無菌過濾液平板拮抗測定柑桔潰瘍病菌,28℃下培養24h,測量抑菌圈直徑.5)K-18的抗生素成分初步測定.對K-18的無菌濾液分別進行水合茚三酮反應和α-萘酚試驗,測定是否含有蛋白多肽類物質或糖類物質.6)防效試驗.1999年4月在湖南農業大學植病研究室進行溫室防效試驗,4月13日噴霧接種,5月16日記錄各株甜橙的發病情況.將培養的新鮮潰瘍病菌懸浮液稀釋到菌體含量為1×109/mL,K-2,K-18懸浮液各自稀釋為3×108/mL.將有新梢的18株甜橙按新梢葉片分為3組,每組葉片數基本相等,設3個處理:Ⅰ.同時接種柑桔潰瘍病菌和K-2菌;Ⅱ.同時噴霧接種柑桔潰瘍病菌和K-18菌;Ⅲ.只接種柑桔潰瘍病菌,作為對照.接種后保濕5d.第25天調查記錄各葉的病斑數,并進行K-2,K-18菌的分離.計算各組葉片的發病率、病情指數.1999年7月在湖南衡山縣園藝場進行大田防效試驗.選取3株10年生甜橙樹,每株選取7枝位于不同方向的當年生夏梢,將菌體含量為1×109/mL的柑桔潰瘍病菌懸浮液與菌體濃度均為3×108/mL的K-18,K-2懸浮液按以下方式對各個枝條進行噴霧接種.A.同時噴施病原菌與K-18;B.先噴施病原菌,2d后再噴施K-18;C.先噴施K-18,2d后再噴施病原菌;D.同時噴施病原菌與K-2;E.先噴施病原菌,2d后再噴施K-2;F.先噴施K-2,2d后再噴施病原菌;G.只噴施病原菌,作為對照.第23天調查各葉的病斑數,并進行K-2,K-18菌的分離.計算各組葉片的發病率、病情指數.7)柑桔潰瘍病病情分級標準.0級,0個病斑;1級,1～5個病斑;2級,6～10個病斑;3級,11～20個病斑;4級,21個以上病斑.2結果與分析2.1兩組菌株對柑橘社會養菌圈的生長采用平板稀釋分離法分離具有潰瘍病斑的新鮮甜橙葉片,得到柑桔潰瘍病病菌Xanthomonasaxonopodispv.citri7個菌株.分離從衡山農科所、南岳園藝場等地采回的材料,得到29個細菌菌株,6個真菌菌株,依次編號為K-1,K-2,……,K-35.用這些菌株進行對柑桔潰瘍病菌的平板拮抗測定,發現K-2,K-18對柑桔潰瘍病菌具有拮抗作用,溶菌圈大小分別為18mm×19mm,51mm×52mm,其他菌株無拮抗效果.2.2菌體及細胞生長特性K-2,K-18的菌體細胞都為桿狀,單個,成雙或成鏈狀排列,極生鞭毛.K-2菌體細胞長1.3～2.4μm,寬0.4～0.6μm,革蘭氏染色陽性,菌落為圓形、扁平、表面皺折、邊緣不整齊、不透明、乳白色,菌落直徑1～2cm,5d后變為淺黃色.K-18的菌體細胞長1.3～2.9μm,寬0.58～0.75μm,革蘭氏染色陰性,菌落為圓形、隆起、邊緣不整齊、有時呈假根狀、半透明、白色,表面光滑,有粘性.2.3最適生長ph值的測定由K-2,K-18的吸光值(圖1)可見,K-2,K-18菌分別在pH值為7.0,7.5時吸光值最大,表明K-2菌生長的最適pH值為7.0,K-18菌生長的最適pH值為7.5.2.4k-18菌對柑橘腐爛病原菌的溶菌圈采用平板測定方法,發現K-18的無菌濾液能對病原菌產生非常明顯的溶菌圈,處理48,72h后溶菌圈大小為32mm×31mm,34mm×33mm.而K-2無菌濾液產生的溶菌圈不很明顯,處理48,72h后溶菌圈大小為8mm×9mm,9mm×10mm.說明K-18菌能產生對柑桔潰瘍病菌具有較強溶菌效果的抗生物質.2.5氨基多肽和非芳烴-酚類物質的表征K-18無菌濾液加入0.2%水合茚三酮溶液后在沸水中加熱5min,變為紫色,為陽性,表明其中含有氨基多肽類物質.其α-萘酚試驗結果為陰性,表明所產生的抗生類物質為非糖類.2.6k-2和k-18對柑橘世界區域防治效果由溫室防治效果(表1)發現,對照只接種潰瘍病菌的葉片發病率達76.1%,病情指數達30.7.同時分別噴施了K-2,K-18的葉片發病率分別降低65.9%,71.4%,病情指數分別減小28.2,29.5,并能從葉片上再次分離到這兩種細菌.說明K-2,K-18在溫室中對柑桔潰瘍病具有良好的防治效果.由表1可知,大田防效試驗中,噴施了K-2,K-18的葉片發病率降低16.4%～31.6%,病情指數減小14.4～28.8,并能從葉片上再次分離到這兩種細菌.說明K-2,K-18在大田中對柑桔潰瘍病都具有較好的防治效果.不同處理的防治效果比較可知,K-18與病原菌同時接種時發病最輕,其原因可能是兩者同時大量存在于葉表時,K-18所產生的抗生物質直接殺死了病原菌.先接種K-2菌,2d后再接種病原菌的一組發病率最低,病情指數也最小,可能是K-2在葉上具有較強的定殖能力,能占據葉表位點,特別是氣孔的周圍,阻止病原菌的侵入.3k-18的不同對柑橘排他病的防治效果a.從分離結果看,柑桔葉表微生物種類繁多,有必要進一步對柑桔葉、果表面微生物在不同生長季節的動態變化進行研究,以發現這種變化與病害發生之間的相互關系.b.K-18產生的抗生素對柑桔潰瘍病病菌具有溶菌作用,其作用機制正在研究之中.c.K-2