毛細管電泳-激光誘導熒光光譜法檢測谷胱甘肽

谷胱甘醇（gsh）是一種由谷氨酸（gsh）、半胱氨酸（cysy）和甘氨酸（gly）通過氨基酸化合物關系生產的具有生物活性的二羥化合物（圖1）。自然界中谷胱甘肽以還原型(GSH)和氧化型(GlutathioneOxidized,GSSG)2種狀態存在,通常所說的谷胱甘肽是指還原型谷胱甘肽。人工已研制開發出的谷胱甘肽藥物,廣泛應用于臨床,除利用其巰基解毒外,還用在肝炎、溶血性疾病以及角膜炎、白內障和視網膜疾病等,作為輔助治療的藥物。目前關于谷胱甘肽的檢測方法較多,如高效液相色譜法,熒光法,與各種檢測器結合的毛細管電泳法和其他電化學檢測法等。同時檢測谷胱甘肽及其構成氨基酸的方法較少,僅見于使用高效液相色譜法來同時檢測這五種物質。本實驗建立了一種分離測定還原型和氧化型谷胱甘肽及其構成氨基酸的毛細管電泳-直接LIF法。五種物質經NBD-Cl衍生后,在含有Brij-35和乙腈的硼砂緩沖體系中得到了較好的分離。該方法被應用于注射用谷胱甘肽鈉粉針樣品的分析,得到了比較理想的效果,有望應用于谷胱甘肽藥物制劑的質量監控以及為谷胱甘肽及其藥物代謝研究奠定了一定的基礎。1實驗部分1.1儀器、試藥與儀器貝克曼P/ACETMMDQ型毛細管電泳系統(BeckmanCoulterInstrument,Fullerton,CA,USA):配有使用氬離子激光光源的激光誘導熒光檢測器(λex/λem=488/520nm),系統由安裝32Karat軟件(8.0版)的聯想電腦控制。未涂層熔融石英毛細管(總長度50.2cm,有效長度40cm,內徑為75μm,河北永年銳灃色譜器件有限公司);KQ-250DE型數控超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司);pHS-3C酸度計(成都世紀方舟科技有限公司);MilliporesynergyUV超純水系統(Milford,MA,USA);V0876X-5型混旋儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。氧化型谷胱甘肽(純度98%),聚氧乙烯月桂醚(Brij-35,AR),購自百靈威科技有限公司;還原型谷胱甘肽(純度99%),L-谷氨酸(純度98%),L-半胱氨酸(純度98%),甘氨酸(純度98%),購自阿拉丁公司;4-氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑(NBD-Cl,比利時Acros公司);硼砂(AR,Sigma);乙腈(AR,四川航嘉生物醫藥科技有限責任公司);注射用還原型谷胱甘肽鈉凍干粉針劑(綠葉制藥,購于成都市第一人民醫院);HCl,NaOH(AR,成都市科龍化工試劑廠);實驗用水為超純水。1.2nbd-cl和乙腈溶液的配制稱取還原型和氧化型谷胱甘肽、L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸,加水溶解,配制成1g/L標準儲備液,實驗中用超純水稀釋至所需濃度。將NBD-Cl溶于乙腈,配制成100mmol/L儲備液,實驗中用乙腈稀釋至所需濃度。所有儲備液均在4℃冰箱儲存備用。1.3谷胱甘肽鈉的含量樣品鑒定:準確稱量谷胱甘肽鈉藥品總重為0.6620g,藥瓶上標示藥品的有效成分總重為0.06g,則藥品中谷胱甘肽鈉的含量為90.6%。樣品配備:配制谷胱甘肽鈉(純品)含量為2000μg/mL的樣品溶液。放入冰箱中4℃冷藏保存。實驗中用超純水將其稀釋至所需的濃度。1.4nbd-cl的制備依次向1mL的微型離心管中加入50μL樣品標準溶液(或樣品溶液)、100μL衍生緩沖溶液和100μLNBD-Cl溶液,充分混合后,將上述溶液置于50℃水浴中反應20min,待反應混合物冷卻至室溫后,用超純水稀釋至0.5mL。混合均勻后直接進樣分析。對于空白溶液的制備,需向離心管中加入超純水50μL,其余操作步驟和對標準溶液(或樣品溶液)的衍生過程相同。1.5毛細管的沖洗運行緩沖溶液:15mmol/L硼砂,20mmol/LBrij-35,10%乙腈(體積比),pH9.75。新毛細管使用前分別用甲醇沖洗5min,1.0mol/LHCl、1.0mol/LNaOH和超純水各沖洗10min;每天實驗前毛細管用1.0mol/LHCl、0.5mol/LNaOH、超純水和分離緩沖溶液各沖洗5min;兩次運行之間,毛細管依次用0.5mol/LNaOH沖洗1min,去離子水沖洗2min,分離緩沖溶液沖洗3min。分離電壓17.5kV,分離柱溫25°C,0.5psi(3447.5Pa)壓力進樣3s。2結果與討論2.1對于分離條件的優化2.1.1緩沖液ph值的影響緩沖液pH值一方面通過改變毛細管內壁電荷極性及密度來影響電滲流,另一方面通過改變分析物的帶電性質來影響待測物質的遷移行為。本實驗在pH8.5～9.75范圍內考察了緩沖液pH值對分離的影響。pH為8.5和9.0時,分離度均不好,有的峰沒有分開;pH為9.75時分離度較好,但是熒光強度明顯減弱,pH為9.5時,分離度和峰型都優于其他的條件,分離效果最好,故實驗選擇分離緩沖溶液的pH值為9.5。2.1.2分離帶影響實驗考察了不同Brij-35濃度(10～30mmol/L)對分離的影響。當Brij-35濃度為20mmol/L時,分離度、峰型和峰高都明顯優于10mmol/L或30mmol/L的時候,故實驗選擇20mmol/LBrij-35為最佳條件。2.1.3乙腈對乙腈分離效果的影響向膠束電動色譜分離體系中添加有機改性溶劑可以改善分離度,但是有機溶劑也會延長出峰時間。實驗考察了0%、5%和10%(體積比)兩個濃度的乙腈對分離效果的影響,見圖2。可以看出,乙腈濃度為5%(體積比)時,出峰時間明顯比乙腈濃度為10%(體積比)時短,但兩種情況下的分離度并沒有太大的變化,所以實驗選擇乙腈濃度5%(體積比)。2.1.4緩沖液濃度的影響緩沖液的濃度直接影響到緩沖液的電導率以及毛細管內壁與緩沖液之間的電勢。緩沖液濃度較低時,內壁與緩沖液之間的電勢大,電滲流較高,遷移時間短,分離不完全;緩沖液濃度較高時,電導率和電流都增大,產生較多的焦耳熱,會增加分析物的擴散程度,導致峰形變差。因此選擇合適的緩沖液濃度對分離效率有很大的影響。本實驗考察了4個濃度水平(15、20、25、30mmol/L)的硼砂緩沖溶液對分離的影響。結果表明,在硼砂濃度為25mmol/L時分離度和峰型均較好,因此,實驗選擇分離用硼砂緩沖液濃度為25mmol/L。2.1.5為分離柱溫毛細管柱溫能通過對緩沖溶液粘度的作用而改變電滲流,進而影響分析物的遷移時間及其分離度。實驗考察了柱溫15～35℃對分離的影響,溫度梯度設置為15、20、25、30、35℃,結果表明分離柱溫為25℃時分離效果較好,所以選用25℃為分離柱溫。分離電壓能直接影響電滲流和焦耳熱的大小,進而影響分析物的遷移時間和系統的分離能力。實驗考察了電壓15～30kV對分離的影響,電壓梯度設置為15、20、25、30kV,結果表明分離電壓為20kV時分離效果較好,所以選用20kV為分離電壓。2.2優化生產條件2.2.1gly衍生產物的熒光強度NBD-Cl衍生化反應在室溫下一般反應較慢。本實驗在30～70℃范圍內考察了反應溫度對衍生效率的影響,見圖3。在50℃以下,隨著溫度的升高,五種物質熒光產物的熒光強度也增強;50℃以上,GSH和Glu衍生產物的熒光強度繼續隨溫度上升而增強,Gly衍生產物的熒光強度在50℃后緩慢增強幾乎趨于平穩,Cys和GSSG熒光產物在溫度超過50℃時,熒光強度下降。這可能是因為Cys在高溫下不穩定變質,綜合考慮,實驗選擇50℃為最優反應溫度。維持反應溫度50℃,在10～60min范圍內考察了反應時間對衍生效率的影響。衍生產物的熒光強度隨著反應時間的增加而增加,在20min時半胱氨酸衍生產物的熒光強度達到最高,其他物質衍生產物熒光強度增幅變緩。綜合考慮之下,實驗選擇衍生時間為20min。2.2.2緩沖液ph值對衍生效率的影響NBD-Cl與胺的衍生反應屬于典型的親核取代反應。堿性條件有利于反應的進行,本實驗在pH8.0～9.5范圍內考察了緩沖液pH值對衍生效率的影響(圖4)。可以看出,在相同的反應溫度和時間條件下,Glu衍生產物的熒光強度隨pH的上升而增強,GSH衍生產物的熒光強度幾乎不隨pH值的變化而變化,其他三種物質衍生產物的熒光強度在pH9.0時達到最高。綜合考慮,實驗選擇衍生緩沖液pH值為9.0。2.2.3nbd-cl濃度衍生試劑NBD-Cl的濃度可以監控衍生反應進行的完全程度,同時也會影響衍生產物的熒光強度。本實驗在10～50mmol/L范圍內考察了NBD-Cl濃度對衍生效果的影響。結果表明,衍生產物的熒光強度隨著試劑濃度的增加而增強,在濃度高于30mmol/L后,衍生產物熒光強度趨于平穩。考慮到樣品中可能存在與NBD-Cl反應的未知成分,實驗選擇40mmol/L作為衍生試劑的最優濃度。2.2.4最佳分離條件的確定本實驗分別在10、20、30、40、50mmol/L5個濃度下考察了硼砂緩沖液濃度對衍生產物熒光強度的影響,。硼砂濃度為30mmol/L時,可以獲得較好的峰型、靈敏度、分離度。因此,實驗選擇衍生緩沖液的硼砂濃度為30mmol/L。綜上,得出最佳分離條件:25mmol/L硼砂,20mmol/LBrij-35,5%乙腈(體積比),pH9.5,分離溫度為25°C,分離電壓為20kV。圖5為最佳衍生條件和最佳分離條件下得到的電泳譜圖,被分析的五種物質在11min內實現基線分離。2.3方法評估2.3.1還原型谷胱甘肽和半胱氨酸衍生添加量的確定本實驗所測的五種物質中,還原型谷胱甘肽和半胱氨酸極不穩定,為保證實驗數據的準確性,對這兩種物質進行了穩定性實驗。采用內標法,以甘氨酸作為內標物,分別配制還原型谷胱甘肽和半胱氨酸與甘氨酸的混合溶液,用上述得出的最佳條件衍生,衍生后按照:立即進樣、室溫中放置1h、2h、3h、4h、6h、8h后進樣,用毛細管電泳儀檢測分析。實驗表明:還原型谷胱甘肽在6h內性質穩定,半胱氨酸在3h內性質穩定。2.3.2還原型谷胱甘肽gsh及氨基酸glu還原型和氧化型谷胱甘肽及三種氨基酸的檢測限在0.001～0.1μg/mL范圍。還原型和氧化型谷胱甘肽及半胱氨酸線性范圍在1～50μg/mL,谷氨酸在0.5～25μg/mL范圍,甘氨酸在0.1～20μg/mL范圍,線性方程及相關系數為:還原型谷胱甘肽(GSH),y=20864x-26494(r2=0.9996);氧化型谷胱甘肽(GSSG),y=54723x-3555.2(r2=0.9995);谷氨酸(Glu),y=476390x-36093(r2=0.9994);半胱氨酸(Cys),y=6990.8x-3639.1(r2=0.9997);甘氨酸(Gly),y=2E+06x-35039(r2=0.9999)。表明在線性范圍內五種物質均成良好的線性關系。2.3.3氨基酸g/ml,ld在同一天內,在得出的優化條件下,取五種物質標準品,經連續測定5次,得到日內精密度。還原型谷胱甘肽2μg/mL,RSD為2.02%;氧化型谷胱甘肽2μg/mL,RSD為1.99%;谷氨酸0.2μg/mL,RSD為2.63%;半胱氨酸2μg/mL,RSD為2.36%;甘氨酸0.1μg/mL,RSD為2.12%。連續3天進行測定日間精密度,每天均配制新鮮的緩沖溶液,在優化條件下檢測五種物質標準品。還原型谷胱甘肽2μg/mL,RSD為2.76%;氧化型谷胱甘肽2μg/mL,RSD為3.36%;谷氨酸0.2μg/mL,RSD為1.73%;半胱氨酸2μg/mL,RSD為3.51%;甘氨酸0.1μg/mL,RSD為2.56%。2.3.4多目標物主色系的聚合分析實測樣品的純度為93.5%,與之前計算得到樣品理論純度90.6%基本一致。樣品電泳譜圖如圖6。向已知分析物含量的樣品(即原來分析過的樣品)中分別加入不同量的目標標準品(分別為測得樣品已知含量的80%,100%,120%),然后將該混合物