基于aflp標(biāo)記的新疆核桃種質(zhì)材料遺傳多樣性分析

新疆堅果的種子資源豐富。新疆分布著天然的堅果林。新疆南部有早熟堅果和薄皮堅果，全國各地都分布著許多古老的堅果樹種，樹齡數(shù)百年。核桃種質(zhì)資源遺傳多樣性研究是核桃種質(zhì)資源學(xué)研究的重要內(nèi)容和核桃新品種選育的理論基礎(chǔ)。由于近年來核桃產(chǎn)業(yè)在全疆乃至全國的不斷發(fā)展,核桃良種和無性系生產(chǎn)逐步深入和擴大,資源遭受嚴(yán)重破壞,一些適應(yīng)性強的地方品種和野生種逐漸被淘汰,物種有向單一化發(fā)展的趨勢。利用遺傳標(biāo)記對核桃資源進行遺傳多樣性分析,可為資源的保護和利用提供可靠有效的理論依據(jù),還可以搞清楚核桃種質(zhì)資源內(nèi)的物種關(guān)系,為核桃遺傳育種及遺傳規(guī)律的研究奠定基礎(chǔ)。AFLP技術(shù)具有可靠、高效、快速、靈敏、穩(wěn)定、所需DNA量少、多態(tài)性檢出率高和重復(fù)性好等特點,該方法近年來發(fā)展很快,國外和國內(nèi)已用該技術(shù)對核桃進行了一些研究,而針對新疆核桃資源的研究相對很少。國內(nèi)目前已做了關(guān)于核桃的DNA提取、AFLP擴增體系的建立、引物篩選和遺傳多樣性、親緣關(guān)系、性狀分子分析等方面的研究,國外已經(jīng)對稀有核桃種質(zhì)的遺傳多樣性及遺傳連鎖圖的構(gòu)建方面做了相關(guān)工作。本研究是在借鑒前人研究經(jīng)驗的基礎(chǔ)之上,用AFLP技術(shù)對新疆的核桃種質(zhì)資源進行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析,以期為今后新疆核桃種質(zhì)資源的保護、新品種選育和改良、遺傳規(guī)律研究等方面奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1阿斯塔里木大學(xué)中小企業(yè)供試材料共122份(表1),包含11個普通核桃栽培品種以及81份野生、實生核桃類型,其中有百年核桃4份。分別于2006年9月、2007年6月、2007年8月采自新疆阿克蘇地區(qū)溫宿核桃林場及庫車縣、庫爾勒若羌縣、喀什葉城縣、和田地區(qū)、伊犁鞏留野生核桃林自然保護區(qū)及阿拉爾市塔里木大學(xué)試驗站。采核桃葉片,低溫下帶回實驗室,液氮速凍,放入超低溫冰箱中保存待用。1.2研磨、提取、清洗參考已報道的方法并進行改進。采用β-巰基乙醇和PVP聯(lián)合除酚、多次洗滌和高鹽相結(jié)合進行除糖。在研磨組織時加入PVP粉劑,防止組織在破碎過程中被多酚氧化。在提取液Ⅰ、Ⅱ中加β-巰基乙醇和PVP,防止提取和裂解過程中的多酚氧化。在基因組DNA釋放之前用提取液Ⅰ進行多次洗滌,以除去多糖。同時在提取過程中加入5mol/LNaCl,沉淀以70%乙醇浸泡2~3h,協(xié)助除糖。1.3aflp分析1.3.1酶切和連接1.3.1.酶切溫度ld酶切體系20μl:純化DNA450ng,10倍反應(yīng)緩沖液2μl,10mg/mlBSA0.2μl,EcoRI和MseI各3U,加ddH2O至20μl混勻后,37℃恒溫酶切5h。1.3.1.酶切連接酶試驗連接體系5μl:50μmol/LMseI接頭和50μmol/LEcoRI接頭各1μl,10mg/mlATP1.8μl,T4緩沖液0.5μl,T4連接酶1.5U,加ddH2O至5μl混勻后,加入酶切過的DNA樣品中,37℃恒溫10h以上或過夜。連接完成后,65℃變性10min。1.3.2選擇性pcr65預(yù)擴增反應(yīng)體系20μl:含5.0μl連接后經(jīng)5倍稀釋產(chǎn)物作為預(yù)擴增的模板,含Mg2+的10×PCRbuffer2.0μl,2.5mmol/LdNTPs1.6μl,Taq酶0.5U,預(yù)擴增引物各30ng,加ddH2O至20μl混勻后,礦物油封口,95℃預(yù)變性2min;95℃30s,56℃30s,72℃1min,30個循環(huán)。預(yù)擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳檢測,呈均勻的彌散熒光。預(yù)擴增產(chǎn)物再稀釋5倍,取5.0μl作為選擇性擴增的模板,選擇性PCR擴增反應(yīng)體系是20μl體系,其中預(yù)擴增稀釋樣品5.0μl,含Mg2+的10×PCRbuffer2.0μl,2.5mmol/LdNTPs1.8μl,EcoRⅠ引物和MseⅠ引物各0.8μl,Taq酶0.75U,加ddH2O至20μl。95℃預(yù)變性2min;第一個循環(huán)95℃50s,65℃40s,72℃1min,以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7℃,擴增13個循環(huán);然后95℃50s,56℃40s,72℃1min,擴增31個循環(huán);72℃10min,4℃保存。1.3.3冰浴溫度的確定選擇性擴增完成后,在其產(chǎn)物中加入10μlloadingbuffer[98%甲酰胺,0.5mol/LEDTA(pH值8.0),二甲苯氰,溴酚藍],混合后95℃變性10min,立即冰浴15min,置于-20℃下備用。制備6%變性膠(19∶1的聚丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺,7.0mol/L尿素,1×TBE緩沖液),恒功率60W,預(yù)電泳30min,上樣7μl,恒功率40W,電泳至溴酚藍接近膠底后停止電泳。用銀染法染色,ddH2O漂洗3~4s,0.1%硝酸銀+0.15%甲醛染色15min后ddH2O輕微漂洗3~4s。用0.28mol碳酸鈉+0.15%甲醛+400μl硫代硫酸鈉(10mg/ml)顯影,70r/min慢搖。當(dāng)帶紋與背景對比度最清楚時,用10%冰醋酸終止顯色,用ddH2O漂洗2min,觀察結(jié)果。1.4數(shù)據(jù)聚類分析對AFLP圖譜按條帶有無進行賦值,有帶賦值為“1”,無帶賦值為“0”,選擇分辨清晰的強帶進行統(tǒng)計,統(tǒng)計每對引物擴增出的總條帶和多態(tài)性條帶,利用DPS軟件按Nei(1972)的方法計算遺傳相似系數(shù)和遺傳距離,用UPGMA方法聚類。2結(jié)果與分析2.1引用的過濾和avl分析的多態(tài)性2.1.1aflp分析引物篩選用預(yù)擴增反應(yīng)體系,從報道過97、、清晰的選擇性擴增引物組合,分別是:E+AAG/M+CAC,E+ACC/M+CAC,E+AAG/M+CAG,E+AAG/M+CAT,E+AGG/M+CAT,E+AAC/M+CTA,E+ACG/M+CTG(表2)。2.1.2AFLP分析多態(tài)性利用AFLP技術(shù)對122份核桃種質(zhì)的基因組DNA進行分析。為了能夠覆蓋基因組盡可能多的遺傳位點,研究選用六堿基內(nèi)切酶EcoRⅠ和四堿基內(nèi)切酶MseⅠ對基因組DNA進行雙酶切,然后與接頭連接。用7對E+3/M+3引物組合(表2)進行選擇性擴增,對條帶進行統(tǒng)計分析。這7對引物的擴增產(chǎn)物穩(wěn)定,擴增圖譜清晰。圖1是引物組合E+AAC/M+CTA對1~62號種質(zhì)進行擴增的圖譜,在不同種質(zhì)之間呈現(xiàn)明顯的多態(tài)性,能較好地區(qū)分不同種質(zhì),尤其是23號種質(zhì)(溫179)在不同引物對的擴增圖譜中都呈現(xiàn)最多條帶,且能與其他種質(zhì)明顯區(qū)分開。在所有引物組合擴增出的21989條清晰的條帶中,有多態(tài)性條帶8810條,占40.1%,表明這些核桃種質(zhì)間存在較豐富的遺傳多樣性。2.2個核桃種質(zhì)間的距離關(guān)系所有核桃種質(zhì)的遺傳距離數(shù)值范圍為0.12000~0.93103。物種間遺傳距離最大的是63號種質(zhì)(和22)和1號種質(zhì)(庫車693),距離為0.83930;其次是23號種質(zhì)(溫179)和1號種質(zhì),距離為0.70525;遺傳距離最小的是8號種質(zhì)(伊0117)和5號種質(zhì)(伊0269)、33號種質(zhì)(葉23)和32號種質(zhì)(葉24),距離為0.00000。取自鞏留縣的野生核桃種質(zhì)間遺傳距離變化范圍為0.78571~0.87234,平均距離為0.86774;阿克蘇地區(qū)(庫車縣、溫宿縣、阿拉爾市)的栽培核桃種質(zhì)間遺傳距離變化范圍為0.12000~0.92157,平均距離為0.443690;葉城縣栽培核桃種質(zhì)間距離范圍為0.30769~0.93103,平均距離為0.63482;和田市栽培核桃種質(zhì)間距離范圍為0.2549~0.91489,平均距離為0.69161。這4個核桃種質(zhì)居群平均距離關(guān)系為0.86774(鞏留縣,野生種質(zhì))>0.69161(和田市,栽培種質(zhì))>0.63482(葉城縣,栽培種質(zhì))>0.44369(阿克蘇地區(qū),栽培種質(zhì)),這表明栽培核桃種質(zhì)整體上在長期栽培和定向選擇過程中可能接受了外來種質(zhì)的遺傳物質(zhì),因而出現(xiàn)了遺傳上的進化,而野生種質(zhì)仍沒有受到外來種質(zhì)的干擾,表現(xiàn)出遺傳進化上的保守性。而居群間單個核桃種質(zhì)的遺傳距離上限值關(guān)系是0.93103(葉城縣,千年核桃王,87號)>0.92157(溫宿神木園,千年核桃,97號)>0.91489(和田市,百年核桃,47號)>0.87234(鞏留縣,野生核桃,9號)。這表明最古老的核桃種質(zhì)在南疆地區(qū)(葉城、溫宿、和田),而整體遺傳基礎(chǔ)較廣的核桃種質(zhì)仍在北疆鞏留縣(野核桃林)。溫宿縣的早實、薄皮核桃種質(zhì)溫81、溫179、新豐等在栽培中品質(zhì)表現(xiàn)優(yōu)良,該核桃居群的長期進化受到外來種質(zhì)干擾和人為定向選擇的影響程度較深,這與其平均遺傳距離小于其他居群的結(jié)果吻合。2.3不同產(chǎn)地核桃聚類分析聚類分析結(jié)果將所有供試材料分成了兩大類群(圖2),分別為1~61號、62~122號。第一類群(1~61號)可分為5個亞類,第Ⅰ亞類包括16份種質(zhì),包括4組類型:第一組由1號、2號組成,取自庫車縣;第二組包括16號、17號、18號、20號、21號、23號、26號、28號共8份材料,主要取自溫宿縣核桃林場;第三組包括25號、27號、35號、50號共4份材料,前2個取自葉城縣,后2個取自和田市;第四組包括29號和44號2個材料,都取自葉城縣。第Ⅱ亞類共有29份種質(zhì),包括3組類型:第一組包括24號、33號、40號、49號、56號、57號、60號共7份材料,24號為取自鞏留縣的黑核桃,其余取自葉城縣及和田市;第二組包括30號、31號、32號、34號、36號、37號、38號、39號、41號、42號、45號、47號、51號、52號、53號、54號、55號、58號、59號、61號共20份材料,取自葉城縣與和田市;第三組包括43號和46號,取自和田市。第Ⅲ亞類由48號材料獨立構(gòu)成,取自和田市。第Ⅳ亞類共有14份種質(zhì):3號、4號、5號、6號、7號、8號、9號、10號、11號、12號、13號、14號、15號、19號,其中3號取自若羌縣,19號取自溫宿縣,其余取自鞏留縣。第Ⅴ亞類只有22號1份種質(zhì)。第二類群(62~122號)可分為2個亞類。第Ⅰ亞類包括59份種質(zhì),分3種類型:第一組包括13份材料,有62號、63號、65號、66號、69號、70號、71號、73號、75號、80號、81號、85號、86號,取自葉城縣與和田市;第二組包括45份材料,包括除第一組及87號、103號、98號外的其余種質(zhì),取自葉城縣、和田市、溫宿縣和阿拉爾市;第三組為98號,取自阿拉爾市。第Ⅱ亞類只有87號和103號2份材料,分別取自葉城縣和阿拉爾市。由聚類圖可以看出,新疆核桃各居群種質(zhì)之間存在差異,在圖上得到很好的區(qū)分。聚類圖展現(xiàn)了一定的地域特征,同一產(chǎn)地的核桃種質(zhì)基本被聚在同一個類群中,各居群之間核桃種質(zhì)資源存在交流現(xiàn)象,鞏留的野生核桃和溫宿的薄皮核桃聚在一個類群,溫宿神木園的千年核桃與葉城、和田的古老資源聚到一起。盡管有交流,但是各居群多數(shù)核桃種質(zhì)還是聚在一起,第二類群主要是葉城、和田的。特優(yōu)薄皮核桃栽培品種“溫81”(22號材料)獨自聚在第一類群的一個亞類,而且其他種質(zhì)與它存在明顯的距離,可能正是這比較寬的遺傳基礎(chǔ)使其在栽培實踐中表現(xiàn)出特優(yōu)良的品質(zhì)(皮很薄、質(zhì)地細膩)。圖中24號種質(zhì)是取自鞏留的美國黑核桃,其遺傳距離在0.41176,聚在第一類群的第Ⅱ亞類第一組,可以看出它與新疆其他核桃種質(zhì)的遺傳距離比較近。3討論3.1aflp試驗結(jié)果該研究用7對特異引物對122份新疆核桃種質(zhì)進行多態(tài)性位點擴增,平均多態(tài)性檢出率為40.1%。試驗所用7對特異引物是直接從王紅霞對內(nèi)地核桃的研究結(jié)果中挑選的9對引物中,再用新疆核桃進行篩選所得。體系建立和DNA提取方法都是直接參考前人的研究成果,預(yù)試驗后稍作調(diào)整而成,試驗所用DNA的吸光值(OD260nm/OD280nm)多數(shù)在1.6左右,較理想值稍低,但所得電泳條帶清晰。盡管AFLP技術(shù)比其他分子標(biāo)記技術(shù)對各方面的要求較嚴(yán)格,從多態(tài)性結(jié)果和聚類圖與現(xiàn)實的符合度來看,AFLP技術(shù)在一定程度上將試驗所提供的新疆核桃資源的遺傳多樣性進行了較充分的揭示,評價的有效性是相對客觀的。從擴增帶圖譜上可知23號種質(zhì)(溫179)條帶數(shù)比千年核桃王(87號種質(zhì))的多,從聚類圖上可看出栽培類群與野生古老種質(zhì)之間存在差異,又有交流,個別優(yōu)良材料如溫81(22號種質(zhì))、千年核桃(87號種質(zhì))等的遺傳基礎(chǔ)被進一步證實,充分展現(xiàn)了新疆核桃資源的多樣性和豐富程度。3.2核桃優(yōu)良種質(zhì)的遺傳關(guān)系聚類結(jié)果明顯將所有供試核桃種質(zhì)材料分成兩大類群,第一類群又分成5個亞類,第二類群分成2個亞類,亞類下面又分了若干小組。分類時考慮到了核桃資源的地域性,但資源之間的交流始終無法避免,即各居群核桃資源在被聚成類群、亞類及小組的過程中,各居群的多數(shù)核桃種質(zhì)都聚在一個小組內(nèi),但沒有任何居群獨自聚在一起的,