藏族線粒體dnad-環區遺傳多態性分析

人類骨骼dna（美國高堿基突變率和多胞胎血漿數量的遺傳特征，對人類骨骼的遺傳和進化研究具有重要意義。mtDNA的非編碼區(D-環區)是研究人類群體遺傳和進化的理想遺傳標記,被廣泛地應用于人類遺傳學和法醫個體識別。而西藏藏族mtDNAD-環區多態性的研究尚未見全面報道,本研究以那曲藏族為研究對象,觀察mtDNA的遺傳特點,為研究藏族起源提供遺傳學證據,也為法醫鑒定提供mtDNA序列多態性的基礎數據。1材料和方法1.1樣本36例藏族樣本均采自西藏那曲地區,每個提供樣本的無關個體均身體健康,并追溯到3代以上家族史,EDTA抗凝。1.2ttg-34.5和4.34.34.5和4.34.34.34.34.34.34.34.34.54.54.54.5.4基因表達對交通網絡的生長擴增HVR-Ⅰ引物序列:F159975′-CACCATTAGCACCCAAAGCT-3′R164015′-TGA-TTTCACGGAGGATGGTG-3′。WizardPCRPresDNAPurificationSystem(美國Promega公司)。BigDyeTerminatorSequencing試劑盒(美國ABI公司)。1.3儀器PCR擴增儀(Hybaid)ABIAlvant3100自動測序儀(ABI公司,美國)。1.4提取和定量d酚-氯仿法提取DNA,并用紫外分光光度計測定OD260、OD280,以測定DNA的含量和純度。1.5pcr擴增taq酶擴增體系為50μl,樣本10ng,引物各0.5μmol/L,dNTPs200μmol/L,MgCl21.5mmol/L,10×緩沖液5μl,Taq酶0.3U(Promega公司)。擴增程序:變性94℃4min;退火55℃40s;延伸72℃40s10min,共35個循環,最后72℃延伸10min。擴增產物用PresDNAPurificationSystem試劑盒純化。熒光法測序。1.6變異位點的發現使用ClustalW比對軟件將各個體的序列分別與Anderson序列比較,發現并統計變異位點。按照公式P=∑X2(X為每個個體單倍型頻率)計算偶合概率,公式h=(1?∑X2)n/(n?1)(n為樣本含量)h=(1-∑X2)n/(n-1)(n為樣本含量)計算基因變異度。2結果2.1堿基轉換及創性變化對西藏藏族群體36個無關個體HVR-Ⅰ行測序,發現34種不同的單倍型。Anderson序列是當前國際上普遍應用的mtDNA的標準序列,各序列與其比較,共發現有51處突變部位,堿基轉換141個,占堿基突變的89.81%,其中G-A突變10.19%,A-G突變12.74%,C-T突變38.85%,T-C突變28.03%;堿基顛換9個,占堿基突變的5.73%,其中A-C突變5.10%,C-G突變0.63%。堿基插入1.91%,堿基缺失2.55%。突變的熱點部位出現在16223、16362,其突變頻率分別為83.33%、58.33%(附表)。2.2個體序列多態性由于np16189位出現T-C堿基轉換,在16180-16194區域出現C重復(poly-C),其長度及序列由于受到堿基插入、缺失、轉換、顛換等影響,個體之間出現序列多態性。本研究形成9種單倍型,其中AAAACCCCCTCCCCA(24個),AAAA-TCCCCTCCCCA(2個),AAAACTCCCTCCCCA(2個),AAAACCCCCTCCCCG(1個),AAACCCCCCTCCCCA(2個),GAAACCCCCTCCCCA(1個),AACCCCCCCCCCCCA(2個),AAAACCCCTCCCCCA(1個),AGAACCCCCTCCCCA(1個),合計36個。2.3對納曲藏族mtd-環區基因的基因變異度和偶合概率的分析，我們計算了h.0.9931和h.0.03163藏族群體的遺傳多樣性藏族是我國少數民族之一,世代生活在平均海拔4000m的青藏高原上,由于青藏高原封閉的地理環境和藏族婚俗的對外隔離性,使這一群體形成顯著的遺傳學隔離,是研究藏族人群起源和遷移規律及其與我國其他民族之間親緣關系的良好資源。本研究對西藏那曲藏族mtDNA的多態性進行分析,以期研究藏族與其他民族或種族的親緣關系,以及探討mtDNA的多態性用于藏族群體的個體識別的可能性。本研究發現,藏族個體mtDNA堿基突變的主要形式為堿基轉換,熱點突變主要集中在np16223及np16362位置,這兩處堿基在藏族(83.3,58.3)、中國漢族(62.5,44.2)、日本人(73.8,42.6)、朝鮮人(78.4,38.6)群體中有比較高的突變率,而在法國(10.0,6.0)人群中突變率較低,從而表明藏族人具有亞洲人群明顯的人類學特征。但要準確界定他們之間的親緣關系,還需要擴大樣本量并與相應人群構建系統進化樹。mtDNAD-loop區在遺傳過程中選擇壓力小,突變率高,尤其在HVR-Ⅰ,不僅人群與人群之間有明顯差異,而且每一人群的無關個體之間也存在差異。本研究中發現藏族的有些位點與其他東亞人群間確實存在差異,藏族人在np16093及np16183位置分別出現T-C和A-C堿基替換,而中國漢族人、日本人、朝鮮人卻未發現上述部位的堿基突變,表明藏族在進化過程中保留了其獨特的遺傳特征。此外,由于np16189位出現T-C堿基轉換導致np16180-16194區域形成的poly-C(C重復)序列,日本人、朝鮮人分別有16、19種單倍型,藏族只有9種,而其中1種為日本人、朝鮮人群中未發現的類型,這種少見的突變類型在個體內發生率低,因而對個體識別很有意義。藏族單倍型少,是否與樣本量有關,還需要進一步證實。基因差異度(h)和偶合概率(P)是進行個體識別的重要指標,h值越大,P值越小,作為遺傳標記的價值越大,我們檢測藏族群體的HVR-Ⅰ區h為0.9961,P為0.0316