酸敗成品黃酒中乳酸桿菌培養(yǎng)及菌種初步鑒定

黃酒是以糯米、大米、小米、小米、玉米、小麥等為原料的。通過(guò)浸泡和蒸發(fā)，我們可以通過(guò)各種酶、細(xì)菌、細(xì)菌（菌株、黃酒乳酸桿菌）和其他藥物參與。黃酒（紹興酒、半甜黃酒、半干黃酒和黃酒）的發(fā)酵過(guò)程是糖和母液的三種代謝過(guò)程。同時(shí)，通過(guò)混合和發(fā)酵，將酒精轉(zhuǎn)化為混合和分解，將細(xì)菌（植物作用：黃酒、乳酸菌）轉(zhuǎn)化為具有相同反應(yīng)效果的三個(gè)部分：混合和發(fā)酵。甜黃酒（洋酒）主要是由細(xì)菌（浙江省）發(fā)酵引起的，但細(xì)菌（浙江省）的作用很少。這是細(xì)菌（浙江省）的主要發(fā)酵過(guò)程。在黃酒的發(fā)酵過(guò)程中，有許多類型和密度的細(xì)菌（菌株、黃酒乳酸桿菌）和菌株。近幾年研究報(bào)道:從黃酒釀造中分離鑒定出的乳酸桿菌有戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosusstrain)、棒狀乳桿菌(Lactobacilluscoryniformissubsp.Torquens)、希氏乳桿菌(Lactobacillushilgardii)、植物乳酸桿菌(Lactobacillus.plantarum)、短乳桿菌(Lactobacillus.brevis)、干酪乳桿菌(Lactobacillus.casei)、Lactobacillus.harbinensis、清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)、類植物乳桿菌(Lactobacillusparaplantarum)、彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)等等,在這些分離鑒定出的乳酸桿菌中,以植物乳酸桿菌為最多,因?yàn)橹参锶樗釛U菌的來(lái)源最廣,在黃酒釀造中作用較大。但黃酒釀造過(guò)程微生物種類特別多,有許多新的種及優(yōu)勢(shì)菌種,如黃酒發(fā)酵結(jié)束酒精度達(dá)17.0%vol以上,最高可達(dá)22.0%vol,成品黃酒酒精度在17%vol~20%vol,引起壇裝或大罐貯存黃酒酸敗的主要菌種,不能在現(xiàn)有報(bào)道的培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基、改良MRS培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、米曲汁培養(yǎng)基、加碳酸鈣培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等等)中生長(zhǎng),因此無(wú)法檢測(cè)出。為檢測(cè)出這些引起壇裝或大罐貯存黃酒酸敗的乳酸桿菌,試驗(yàn)研究出了新的檢測(cè)和培養(yǎng)方法,報(bào)告如下。1材料和方法1.1加所需培養(yǎng)的培養(yǎng)基壇裝紹興加飯酒、淋飯酒母、速釀酒母、傳統(tǒng)加飯酒發(fā)酵醪、機(jī)制加飯酒發(fā)酵醪、壇裝酸酒(非漏壇、包裝完好)取自公司生產(chǎn)車間和倉(cāng)庫(kù),淋飯酒母、速釀酒母、傳統(tǒng)加飯酒發(fā)酵醪、機(jī)制加飯酒發(fā)酵醪、壇裝酸酒(非漏壇、包裝完好)所用的取樣瓶、取樣過(guò)程需無(wú)菌操作。理化分析用試劑外購(gòu)。MRS培養(yǎng)基、改良MRS培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、米曲汁培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、米曲汁碳酸鈣培養(yǎng)基等等配培養(yǎng)基的試劑外購(gòu);“X”物質(zhì)外購(gòu)。壇裝紹興加飯酒必須符合《紹興酒》GB/T17946-2008國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),淋飯酒母、速釀酒母、傳統(tǒng)加飯酒發(fā)酵醪、機(jī)制加飯酒發(fā)酵醪為生產(chǎn)正常的批次。壇裝酸酒(非漏壇、包裝完好)為貯存一年或以下過(guò)程中酸敗的酸酒。1.2儀器、設(shè)備和檢測(cè)設(shè)備0.01g電子天平JH3102,上海精科天美科學(xué)儀器有限公司;生化培養(yǎng)箱SPX-250B,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;霉菌培養(yǎng)箱MJX-250B-2,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;光學(xué)顯微鏡XSP-2C,上海尚光顯微鏡有限公司;多用皇冠蓋壓蓋機(jī),鄭州玉祥包裝機(jī)械有限公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;101A-2電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱,上?？德穬x器設(shè)備有限公司;SW-CJ-1F潔凈工作臺(tái),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;YN-ZD-10不銹鋼電熱蒸餾水器,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;無(wú)菌室,自制,在無(wú)菌室內(nèi)放潔凈工作臺(tái),提高無(wú)菌程度;島津氣相色譜儀GC-14系統(tǒng)(柱溫:70℃,汽化、檢測(cè):200℃,進(jìn)樣量:0.5μmL)、AT.LZP-930(18×0.53)白酒分析專用柱,日本島津公司;500mL、200mL壓口蓋玻璃酒瓶,分析用儀器等。2方法3結(jié)果與分析3.1結(jié)果3.2分析4結(jié)論和討論4.1培養(yǎng)基配方的確定2.1MRS培養(yǎng)基的配制、改良MRS培養(yǎng)基的配制、麥芽汁培養(yǎng)基的配制、米曲汁培養(yǎng)基的配制、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的配制、米曲汁碳酸鈣培養(yǎng)基的配制。2.2樣品處理:淋飯酒母、速釀酒母、傳統(tǒng)加飯酒發(fā)酵醪、機(jī)制加飯酒發(fā)酵醪取樣后在無(wú)菌室用一層經(jīng)滅菌過(guò)的紗布過(guò)濾后,接入。壇裝酸酒在無(wú)菌室直接接入。2.3無(wú)菌水試管:10mL蒸餾水試管在高壓滅菌鍋0.1Mpa滅菌30min,放入無(wú)菌室備用。2.4培養(yǎng)基的配制:取壇裝加飯酒,測(cè)定酒精度,而后加水稀釋至酒精度17.0%vol,加入總培養(yǎng)液量0.1%、0.3%、0.5%的“X”物質(zhì),加可溶性淀粉0.3%、0.5%、0.7%,充分?jǐn)噭蛉芙?200mL玻璃瓶分別裝10mL培養(yǎng)液,壓蓋密封,于85℃水浴鍋維持40min滅菌,冷卻后于18℃空白培養(yǎng)3d,而后于30℃空白培養(yǎng)2d,再在85℃水浴鍋維持40min滅菌,放無(wú)菌室備用。“X”物質(zhì)的不同加量、可溶性淀粉的不同加量、培養(yǎng)溫度18℃、25℃、30℃進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)如表1、表2。在無(wú)菌室把經(jīng)一層紗布過(guò)濾的發(fā)酵醪直接接入,壓蓋密封進(jìn)行培養(yǎng),每天觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況,與常規(guī)培養(yǎng)基對(duì)照,并詳細(xì)記錄。選擇出適宜的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)方法。原酒培養(yǎng)基(加飯酒培養(yǎng)基):取壇裝加飯酒,測(cè)定酒精度,而后加水稀釋至酒精度17.0%vol或不稀釋,灌入玻璃酒瓶,壓蓋密封,按上述方法進(jìn)行滅菌,即為原酒培養(yǎng)基(加飯酒培養(yǎng)基)。2.3測(cè)定:通過(guò)正交試驗(yàn)選擇出的培養(yǎng)基配方,配制培養(yǎng)液,于200mL玻璃瓶每瓶分別灌10mL培養(yǎng)液,壓蓋密封;不加可溶性淀粉和“X”物質(zhì)配制成培養(yǎng)液,在500mL玻璃瓶每瓶分別灌300mL培養(yǎng)液,壓蓋密封;上述培養(yǎng)液于85℃水浴鍋維持40min滅菌,冷卻后于18℃空白培養(yǎng)3d,而后于30℃空白培養(yǎng)2d,再在85℃水浴鍋維持40min滅菌,放無(wú)菌室備用。樣品接入300mL優(yōu)選的培養(yǎng)基培養(yǎng)后測(cè)定酒精度、還原糖、總酸、揮發(fā)酸,空白樣對(duì)照,樣品接入10mL培養(yǎng)基觀察生長(zhǎng)速度。樣品稀釋后無(wú)菌接入上述優(yōu)選的培養(yǎng)基中,壓蓋密封,分別在18℃和30℃培養(yǎng),每天觀察培養(yǎng)液混濁情況,培養(yǎng)液混濁,進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定酒精度、總酸(以乳酸計(jì))、還原糖(以葡萄糖計(jì))、揮發(fā)酸(以乙酸計(jì))。酒精度測(cè)定按《黃酒GB/T13662-2008》,總酸(以乳酸計(jì))、還原糖(以葡萄糖計(jì))、揮發(fā)酸(以乙酸計(jì))測(cè)定按參考文獻(xiàn),鏡檢,培養(yǎng)結(jié)束后觀察乳酸桿菌的形態(tài)。仲丁醇、異丁醇、異戊醇、乳酸乙酯微量成份的測(cè)定是用培養(yǎng)液100mL加水100mL在蒸餾器上蒸餾出100mL蒸餾液,蒸餾液在氣相色譜儀上的測(cè)定值。2.4初步鑒定:對(duì)照《伯杰細(xì)菌檢定手冊(cè)(第八版)》和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》進(jìn)行初步鑒定。3.1.1通過(guò)正交試驗(yàn)和以前的試驗(yàn),黃酒發(fā)酵醪及酸敗黃酒中高耐酒精度優(yōu)勢(shì)菌的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)方法為:加飯酒稀釋至酒精度17.0%vol、加“X”物質(zhì)的量0.3%、加可溶性淀粉0.5%或不加、培養(yǎng)溫度18℃或30℃、壓蓋密封培養(yǎng),其他配方組成生長(zhǎng)不佳。酒藥、酒母、生麥曲、浸米漿水、發(fā)酵醪等中酵母在上述優(yōu)選的培養(yǎng)基中不生長(zhǎng),霉菌不生長(zhǎng)。3.1.2不同樣壇裝酸酒(非漏壇、包裝完好、為貯存一年或以下過(guò)程中酸敗的酸酒)直接接入原酒培養(yǎng)基(酒精度分別為1#、2#為18.0%vol和3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#為17.1%vol)中在30℃和18℃分別培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)束測(cè)定結(jié)果如表3。而浸米漿水、麥曲、酒藥、荷葉直接入原酒培養(yǎng)基(酒精度17.1%vol),無(wú)菌生長(zhǎng)。3.1.3在無(wú)菌室,酸酒直接接入優(yōu)選的培養(yǎng)基中培養(yǎng),18℃培養(yǎng)生長(zhǎng)快。30℃培養(yǎng),有部分酸酒中細(xì)菌能生長(zhǎng),培養(yǎng)結(jié)束測(cè)定結(jié)果如表4。而浸米漿水、麥曲、酒藥、荷葉直接入原酒培養(yǎng)基(酒精度16.9%vol),無(wú)菌生長(zhǎng)。3.1.4酸酒直接接入優(yōu)選的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的培養(yǎng)液,在無(wú)菌室用無(wú)菌水稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8分別取1mL接入優(yōu)選的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),純化。并進(jìn)行性能測(cè)定。對(duì)照《伯杰細(xì)菌檢定手冊(cè)(第八版)》和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》進(jìn)行初步鑒定,初步鑒定為乳酸桿菌的新種,暫命名為黃酒乳酸桿菌Ⅲ(Lactobacilluschinese-rice-wineⅢ),有兩類,大部分為18℃生長(zhǎng)良好,25℃以上生長(zhǎng)不良或生長(zhǎng)極慢,但不會(huì)至其死亡,暫命名為黃酒乳酸桿菌Ⅲ-1(Lactobacilluschinese-rice-wineⅢ-1);另一類為30℃生長(zhǎng)良好,18℃以下生長(zhǎng)緩慢或不生長(zhǎng),暫命名為黃酒乳酸桿菌Ⅲ-2(Lactobacilluschinese-rice-wineⅢ-2)。3.1.5黃酒乳酸桿菌Ⅲ(Lactobacilluschinese-rice-wineⅢ)的性能:黃酒乳酸桿菌Ⅲ(Lactobacilluschinese-rice-wineⅢ)是引黃酒貯存過(guò)程中酸敗的主要乳酸桿菌,不能在現(xiàn)有報(bào)道的培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基、改良MRS培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、米曲汁培養(yǎng)基等等)中生長(zhǎng),黃酒乳酸桿菌Ⅲ為厭氧或微需氧,不利用酒精,培養(yǎng)液中需酒精,乙醇能促進(jìn)其生長(zhǎng),能耐酒精度17.0%voL左右,不耐22%voL的酒精,黃酒乳酸桿菌Ⅲ必需特定的維生素等微量成份,能液化淀粉和糊精,能分解蛋白質(zhì)為多肽和氨基酸,產(chǎn)胞外多糖(即粘稠物質(zhì)),產(chǎn)細(xì)菌素,能在低pH3.8左右生長(zhǎng),在pH4.0生長(zhǎng)良好;83℃,10min能滅死黃酒乳酸桿菌Ⅲ。黃酒乳酸桿菌Ⅲ-1(Lactobacilluschinese-rice-wineⅢ-1),18℃生長(zhǎng)良好,25℃或以上生長(zhǎng)不良或生長(zhǎng)極慢,但不會(huì)至其死亡,是引起貯存黃酒酸敗的主要乳酸桿菌,在合適的培養(yǎng)條件下,在成品黃酒中產(chǎn)酸10.0g/L以上,最高產(chǎn)酸達(dá)15.0g/L以上;培養(yǎng)后,總酸為19.4g/L的形態(tài):單生、對(duì)生(——形連接、八字形連接),短鏈,以單生居多,直桿菌,不運(yùn)動(dòng),大小:0.4~1.0×2.5~8.0μm為主。黃酒乳酸桿菌Ⅲ-2(Lactobacilluschinese-rice-wineⅢ-2)為貯存黃酒中在較高溫度中引起酸敗的主要乳酸桿菌,30℃生長(zhǎng)良好,20℃或以下生長(zhǎng)緩慢,在成品黃酒中產(chǎn)酸10.0g/L以上,最高產(chǎn)酸達(dá)15.0g/L以上,總酸達(dá)20.0g/L時(shí)的形態(tài):單生、對(duì)生(——連接、八字形連接),對(duì)生少,八字形連接更少,短鏈、少量長(zhǎng)鏈狀,直桿菌,長(zhǎng)鏈狀無(wú)彎曲狀,大小:0.1~0.5×3.5~10.0μm,少量更長(zhǎng)桿菌,有彎曲狀。3.2.1通過(guò)正交試驗(yàn),優(yōu)選出了分離、培養(yǎng)貯存過(guò)程中酸敗黃酒乳酸桿菌的培養(yǎng)基。此培養(yǎng)基17.0%vol的酒精抑制酵母的生長(zhǎng),在優(yōu)選的培養(yǎng)基中酵母不生長(zhǎng);17.0%vol的酒精、低pH4.0,及快速生長(zhǎng)的乳酸桿菌能夠抑制霉菌的生長(zhǎng),霉菌在此培養(yǎng)基中不生長(zhǎng);芽孢桿菌在17.0%vol不生長(zhǎng)。因此,分離、篩選黃酒乳酸桿菌方便,同時(shí)可快速分離、篩選高耐酒精度的其他乳酸桿菌。原酒培養(yǎng)基(加飯酒培養(yǎng)基)也能培養(yǎng)部分貯存過(guò)程中酸敗黃酒乳酸桿菌,但生長(zhǎng)緩慢,耗時(shí)。而且有一些常規(guī)乳酸桿菌也能在成品黃酒中生長(zhǎng),而使成品黃酒酸敗。3.2.2由于是壓蓋密封液體培養(yǎng),因此黃酒乳酸桿菌Ⅲ(Lactobacilluschinese-rice-wineⅢ)的部分性能無(wú)法測(cè)定,而且是初步鑒定。3.2.3用優(yōu)選的培養(yǎng)基在18℃、30℃培養(yǎng)酒藥、麥曲、荷葉,無(wú)菌生長(zhǎng);可能是優(yōu)選出的培養(yǎng)基沒有達(dá)到黃酒發(fā)酵醪的狀態(tài),而使酒藥、麥曲、荷葉中休眠狀態(tài)的乳酸桿菌生長(zhǎng),需進(jìn)行一步研究。浸米漿水中的乳酸桿菌不耐高酒精度,在優(yōu)選培養(yǎng)和原酒培養(yǎng)基(加飯酒培養(yǎng)基)中不生長(zhǎng)。3.2.4從表3和表4可知:酸黃酒中有異型乳酸桿菌存在,酸黃酒直接入優(yōu)選出的培養(yǎng)基或原酒培養(yǎng)基,異型乳酸桿菌同時(shí)快速生長(zhǎng),在產(chǎn)酸的同時(shí),產(chǎn)一定量的酒精,酒精度升高。異型乳酸桿菌能從精氨酸產(chǎn)氨,被酵母利用產(chǎn)微量的EC。在酒母和前發(fā)酵醪中只有少量黃酒乳酸桿菌Ⅲ-1或黃酒乳酸桿菌Ⅲ-2,但在后發(fā)酵醪及發(fā)酵結(jié)束中大量存在,黃酒乳酸桿菌Ⅲ的來(lái)源是酒藥、麥曲、酒母、工器具、熟地。當(dāng)酒精度升高,其生長(zhǎng)、繁殖,數(shù)量大量增加。煎酒過(guò)程,酒、壇、荷葉等滅菌不徹底及不能滅死壇頸空氣中乳酸桿菌,是引起貯存過(guò)程中黃酒酸敗(非漏壇、包裝完好、密封)的主要原因。4.1.1運(yùn)用正交試驗(yàn)法,優(yōu)選出貯存黃酒酸敗的乳酸桿菌培養(yǎng)、分離的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)方法為:加飯酒稀釋至酒精度17.0%vol、加“X”物質(zhì)的量0.3%、加可溶性淀粉0.5%或不加、培養(yǎng)溫度18℃或30℃、壓蓋密封培養(yǎng)。此培養(yǎng)基也可以培養(yǎng)和檢測(cè)黃酒發(fā)酵醪、貯存酸敗黃酒中的乳酸桿菌及黃酒煎酒、瓶裝酒的滅菌效果。同時(shí)可快速分離、篩選高耐酒精度的其他乳酸桿菌。4.1.2引起貯存黃酒酸敗的乳酸桿菌,在上述培養(yǎng)基中18℃生長(zhǎng)良好,25℃以上生長(zhǎng)不良或生長(zhǎng)極慢,但不會(huì)至其死亡,在現(xiàn)有報(bào)道的培養(yǎng)基中不生長(zhǎng);這是以前從未報(bào)道過(guò)的乳酸桿菌,初步鑒定為乳酸桿菌的新種,是黃酒釀造中所特有的乳酸桿菌,命名為黃酒乳酸桿菌