水溶性提取物mal的分離鑒定

字母糖是母腔的重要組成部分。它的主要成分是大型甘草聚糖和糖蛋白反應。這些體積含有100.300份甘草糖。酵母多糖占酵母細胞壁干重的40%。周義發(fā)等研究表明酵母甘露聚糖主要由α-D-甘露糖組成,分子量為220KD。目前人們對酵母多糖認識和功能研究已取得了較大的進展,研究發(fā)現(xiàn)酵母多糖具有免疫活性和抑制腫瘤生長等作用。最近,國內(nèi)一些報道也證明,酵母多糖對斷奶仔豬具有抗病效果,對大腸桿菌攻毒條件下的仔雞的小腸粘膜也具有保護作用,另外,對小鼠和仔雞的免疫功能也有一定促進作用。在啤酒生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生的大量廢棄物啤酒酵母泥,我們從啤酒酵母泥開發(fā)利用的長遠觀點出發(fā),以啤酒酵母為材料,提取了啤酒酵母多糖,并對多糖的化學組成及抗氧化性質(zhì)進行了初步研究,從而為啤酒酵母多糖的深入研究及其綜合開發(fā)積累資料,提供依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1實驗中的蘑菇啤酒酵母(購自中國科學院微生物研究所菌種保藏中心)1.1.2試劑單糖標準樣品為生化試劑;其它化學試劑均為分析純。1.2方法1.2.1游離蛋白的去除主要參照文獻的方法進行。啤酒酵母細胞用滅菌的0.9%NaCl溶液收集以后,3,000r/min離心20min,沉淀用pH7.2的0.02mol/L檸檬酸緩沖液洗滌形成懸浮液。放入高壓鍋內(nèi)高壓抽提90min。取出冷卻后,以3,000r/min離心20min。冷卻至4℃,加入3倍體積的冷甲醇,出現(xiàn)乳白色沉淀,4℃放置過夜后,3,000r/min離心20min,得白色沉淀,放入干燥器中干燥。重復采用Sevag法去除提取物中的游離蛋白,采用文獻方法檢測樣品中的蛋白含量,直至蛋白含量恒定為止。再用pH值8.8的1%硼酸溶液提取多糖,沉淀溶于2%乙酸溶液中,加入適量乙酸晶體,待充分溶解后,加入3倍體積乙醇,3,000r/min離心20min,收集白色多糖沉淀,干燥,4℃保存?zhèn)溆谩?.2.2具塞酸度法測定總硫酸鈉、苯酚水解反應采用酚硫酸法。準確稱取標準葡萄糖20mg于500mL容量瓶中加水至刻度(40μg/mL)。分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、及1.8mL于具塞刻度試管中,各以水補至2.0mL。再加入6%苯酚1.0mL,濃硫酸5.0mL,靜止10min,搖勻,室溫放置20min,于490nm測定吸光值,同時以2.0mL水作空白對照。取適量樣品液(按實驗中實際情況而定),按上述步驟測定,由標準曲線計算出多糖含量。1.2.3顯色劑的制備樣品處理:20mg多糖加5mmol/L的硫酸在100℃下封管水解5h,用Ba(OH)25mg中和硫酸,過濾收集濾液,即可進行薄層分析。標準單糖溶液的配制:木糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖各2.000g溶解于100mL水中即為20μg/uL樣品。3g硅膠G于9mL0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液中調(diào)成勻漿后,用涂漿器將硅膠涂鋪于10cm×20cm玻璃板上,自然涼干,110℃活化1h。將標樣與樣品液點于硅膠板上,每點上樣20μg,于裝有層開劑(正丁醇∶吡啶∶水=8∶4∶3)100mL的密閉層析缸內(nèi)進行展層,當前沿達到離原點10cm以上取出,涼干。用噴霧器將適量顯色劑(用丙酮配制2%二苯胺,2%苯胺,0.85%磷酸,1%HCl)噴于硅膠板上,85℃的恒溫箱中顯色10min。單糖的薄層掃描定量方法參照CS-930薄層掃描儀操作手冊進行,掃描波長選用390nm。1.2.4對蛋白質(zhì)含量的檢測采用文獻方法檢測除樣品中的蛋白含量。1.2.5b-3-甲基苯基-1,5,5,5%基乙醇的制備準確稱取樣品20mg,加入6mol/LHCl(含有1%草酸和0.05%巰基乙醇),封管,于100℃水解24h,過濾,收集濾液。用Backman6300型氨基酸自動分析儀分析濾液中各氨基酸濃度。1.2.6對葡萄糖的抗逆性的檢測多糖清除O-2作用的檢測采用鄰苯三酚自氧化法2結果與分析2.1糖提取按1.2.1法得到啤酒酵母多糖提取物,命名為Ma1。2.2u3000ph值Ma1能溶于水,溶液無色透明,pH值為6.5。不溶于乙醇、乙醚、丙酮。多糖經(jīng)300～700nm掃描,在370nm處有最大吸收。2.3ma1含有甘露糖的鑒定采用苯硫酸法測定多糖提取物的濃度為75.6%,薄層層析法鑒定發(fā)現(xiàn)Ma1含有甘露糖(圖1)。薄層掃描儀檢測甘露糖占多糖含量的96.8%,表明Ma1的糖鏈主要由甘露糖組成。2.4分析蛋白質(zhì)含量經(jīng)考馬斯亮蘭法鑒定,Ma1的蛋白質(zhì)含量為22.3%,由此可見,提取物為蛋白多糖。2.5氨基酸3種測定Ma1中各氨基酸組成與含量,結果表明Ma1的16種氨基酸,總含量為24.9%。其中包括7種必需氨基酸,含量高達10.6%;另外還含有9種非必需氨基酸,含量達12.0%(表1)。因此啤酒酵母的多糖復合物中含有豐富的氨基酸營養(yǎng)成分。2.6酵母多糖對鄰苯三酚自氧化體系的影響鄰苯三酚自氧化系統(tǒng)常用作的產(chǎn)生O-2和測定SOD酶活性,實驗以蒸餾水為空白對照,室溫下分別測定不同濃度的酵母多糖對鄰苯三酚自氧化體系的影響,并繪出時間進程曲線(圖2)。由圖2可見,在測定體系中加入酵母多糖時,OD425吸收值明顯下降,表明多糖具有明顯的抑制鄰苯三酚的自氧化的作用。3不同ph值對多糖提取的影響在酵母多糖的提取過程中,用溴代十六烷三甲銨除去蛋白質(zhì)后,應用硼酸在堿性條件下能與多羥基復合物形成穩(wěn)定的復合物性質(zhì),將多糖再次沉淀分離出來,這是多糖化學提取法的關鍵一步。首先,多糖濃度和多糖/硼酸鹽的比率會影響多糖的再次沉淀析出率。兩者比例不適合會造成多糖提取失敗。根據(jù)本實驗研究的結果,多糖濃度應不超過2%,多糖/硼酸的比率控制于2左右,才能夠有效地提取多糖。其次,多糖提取液中加入硼酸溶液后,溶液的pH值也是多糖能否沉淀析出的重要因素。逐滴加入NaOH溶液時務必充分攪拌,盡可能地避免局部過堿,同時仔細觀察提取液中反應,當pH值達到一定時,就會出現(xiàn)多糖復合物沉淀。多糖開始發(fā)生沉淀的pH值為8.5,如果pH值超過8.8仍未產(chǎn)生多糖沉淀,就表明多糖提取失敗。研究表明,Mal為蛋白多糖,糖鏈主要由甘露糖組成;其中氨基酸含量豐富,含有7種必需氨基酸,并且具有抗氧化功能;據(jù)報道啤酒酵母多糖還具有促進機體生長與提高免疫功能等作用;因此啤酒酵母多糖具有十分重要的開發(fā)意義。本文研究結果表明酵母多糖具有抗氧化能力,多糖復