覆盆子黃酮抑菌作用的研究

繁殖也被稱為山梨、薔薇科和懸鉤子屬的漿果植物。覆盆子果實(shí)為藥食兩用果實(shí),富含氨基酸、礦質(zhì)元素、有機(jī)酸和VE人體必需的營(yíng)養(yǎng)素外,還含有黃酮、多糖、粗三萜等功能性物質(zhì)。因此,覆盆子具有具有抗衰老、調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)、促進(jìn)細(xì)胞免疫機(jī)能、減肥之功效,有助陽縮尿、補(bǔ)腎固精功能,用于治療陽萎、腎虛遺精、尿頻和遺尿等病癥,對(duì)金黃色葡萄球菌、人型結(jié)核桿菌和霍亂弧菌有較強(qiáng)的抑制作用和延緩肌體衰老,提高免疫能力的作用,因此,覆盆子具有很強(qiáng)的藥用及保健作用。覆盆子黃酮類化合物是覆盆子代謝過程中產(chǎn)生的重要天然有機(jī)化合物,是覆盆子中主要活性成分之一,具有抗氧化、抑菌消炎、消除自由基抗過敏、抗感染、抗突變、抗腫瘤等生理活性,且毒性較低,因此可用作食品、化妝品的天然添加劑,黃酮類化合物一直是國(guó)外研究開發(fā)利用的熱點(diǎn),仍是尋找有開發(fā)應(yīng)用前景的先導(dǎo)化合物。植物中的黃酮類化合物一般呈現(xiàn)弱堿性,它能夠使蛋白質(zhì)凝固變性,具有一定的抑菌和殺菌作用,其他植物黃酮類化合物抑菌、殺菌作用的報(bào)道有一些,但還沒有有關(guān)覆盆子黃酮的抑菌、殺菌報(bào)道,本試驗(yàn)以純化后的覆盆子黃酮為研究對(duì)象,對(duì)其抑菌作用進(jìn)行了探討,旨在為覆盆子的開發(fā)研究及覆盆子黃酮在食品中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面覆盆子干果(一級(jí)品,購(gòu)于衡水市中醫(yī)院藥店)粉碎過60目篩,50℃烘干備用。樣品成分分析中所用化學(xué)試劑均為分析純或生化試劑。1.2細(xì)菌、真菌及毛霉細(xì)菌:大腸桿菌(Eschrichiacoli);枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis);金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(衡水學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏)。酵母菌:啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。霉菌:根霉(RhizopusSP);毛霉(Mucor);青霉(Penicillium)(衡水學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏)。1.3培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基:細(xì)菌培養(yǎng)基;察氏培養(yǎng)基:霉菌培養(yǎng)基;麥汁培養(yǎng)基:酵母菌培養(yǎng)基,新鮮麥芽汁120;2%瓊脂1.4實(shí)驗(yàn)方法1.4.1超聲提取法稱取粉碎后覆盆子粉末100g于三角瓶中,加入1L95%乙醇于50℃下進(jìn)行提取,提取時(shí)間36h,提取中分別于第12h和第24h時(shí)進(jìn)行超聲,超聲功率300W,時(shí)間25min,溫度50℃,提取時(shí)不斷震搖。提取后真空抽濾,真空旋蒸得到膏狀固體物,加純凈水超聲溶解,石油醚萃取三次,取水層,乙酸乙脂萃取三次,真空旋蒸得到黃色粉末。用70%乙醇超聲溶解,經(jīng)AB-8樹脂柱進(jìn)行純化,純化后真空旋蒸得到的黃色粉末狀物,有70%乙醇溶解至濃度為2.56mg/mL。1.4.2懸浮液的制備無菌操作條件下,將活化好的菌株用接種環(huán)分別挑去少量的霉菌孢子、細(xì)菌、酵母菌體,分別接入無菌水中,搖勻,制成菌懸液待用。1.4.3抑菌圈測(cè)定打孔器將濾紙片打孔得到直徑為6mm直徑的圓形濾紙片,置于三角瓶中,高壓蒸汽滅菌處理后,無菌操作將濾紙片浸于各個(gè)藥液中,12h后用無菌鑷子取出,瀝去多余的藥液后按照順時(shí)針方向貼入剛接種的培養(yǎng)基平板內(nèi),37℃下培養(yǎng)24h,觀察有無抑菌圈,用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑。1.4.4細(xì)菌優(yōu)化劑的制備取8支試管各加入2mL液體培養(yǎng)基,第1支試管中加入2mL覆盆子黃酮純化液濃度2.56mg/mL,混勻,自第1支試管中取出2mL混合液加入至第2支試管,依次進(jìn)行,到第8支試管時(shí)棄去2mL,8支試管中分別接入200μL細(xì)菌,取1支不加菌的試管作為空白對(duì)照。37℃下培養(yǎng)24h,觀察記錄不長(zhǎng)菌的最高稀釋藥物濃度為最低抑菌濃度。1.4.5黃酮活性物質(zhì)的研究1.4.5.不同溫度對(duì)覆盆子黃酮抑菌活性的影響無菌操作下,取5個(gè)無菌三角瓶,每瓶中分別移入5mL最低抑菌濃度的覆盆子黃酮稀釋液,分別放入20、40、60、80、100℃的水浴中進(jìn)行加熱,加熱時(shí)間20min,每瓶中接入200μL菌懸液,以對(duì)各菌的最低稀釋濃度進(jìn)行抑菌活性試驗(yàn),比較不同溫度對(duì)覆盆子黃酮抑菌活性的影響。1.4.5.抑菌時(shí)間的測(cè)定用無菌水將覆盆子黃酮提取液稀釋成各種濃度后,以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌,青霉為代表來測(cè)定不同濃度的提取液對(duì)其作用時(shí)間與抑菌率之間的關(guān)系。1.4.5.ph值對(duì)黃酮抑菌活性的影響用稀HCL或NaOH調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基pH,使其pH值分別為4、5、6、7、8、9,用各菌的覆盆子黃酮最低抑菌濃度進(jìn)行抑菌活性試驗(yàn),以比較不同pH值對(duì)抑菌活性的影響。2結(jié)果與討論2.1黃酮的抑菌效果覆盆子純化黃酮對(duì)大腸、枯草芽孢桿等菌的抑菌效果如表1所示。由表1可知,覆盆子純化黃酮對(duì)不同的菌體表現(xiàn)出不同的抑菌特性,能夠被覆盆子黃酮抑制的試驗(yàn)菌有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉且覆盆子黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好,抑菌圈直徑達(dá)到13.50mm,而對(duì)啤酒酵母、根霉、毛霉的抑菌效果不明顯。2.2最佳抑菌濃度的確定覆盆子黃酮最低抑菌濃度測(cè)定結(jié)果如表2所示。由表2可知,覆盆子黃酮對(duì)細(xì)菌的抑菌作用較強(qiáng),最低抑菌濃度分別為大腸桿菌0.16mg/mL,枯草芽孢桿菌0.08mg/mL,金黃色葡萄球菌0.04mg/mL,由最低抑菌濃度可以看出覆盆子黃酮對(duì)試驗(yàn)菌的抑菌效果順序?yàn)?金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌>青霉,這與管碟法檢測(cè)結(jié)果的順序是一致的。由于枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌中既有革蘭氏陽性菌,又有革蘭氏陰性菌,說明覆盆子黃酮對(duì)革蘭氏陰、陽性細(xì)菌都有抑制作用,進(jìn)一步表明覆盆子黃酮對(duì)細(xì)菌有較好的抑菌作用。由表3可知,溫度在100℃以內(nèi),覆盆子黃酮的抑菌效果并不隨溫度的升高而減弱,高于100℃時(shí),覆盆子黃酮的抑菌效果有所減弱,原因可能是高溫對(duì)覆盆子黃酮的抑菌成分有所破壞而導(dǎo)致,總之,在一定的溫度范圍內(nèi),覆盆子黃酮的抑菌效果穩(wěn)定。2.3.2覆盆子黃酮抑菌效果覆盆子黃酮對(duì)試驗(yàn)菌的作用時(shí)間與抑菌率之間的關(guān)系如圖1～4所示。如圖1～4所示,覆盆子黃酮對(duì)幾種試驗(yàn)菌的抑菌率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,且相同時(shí)間內(nèi)對(duì)于同一種菌的抑菌效果,隨覆盆子黃酮濃度的增加而增加,覆盆子黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好,相同濃度的覆盆子黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌同時(shí)間的的抑菌率均高于其它試驗(yàn)菌。2.3.3不同ph值的黃酮抑菌活性由表4可知,覆盆子黃酮的抑菌活性具有較寬的pH值范圍,pH值較低時(shí)有較好的抑菌活性,pH較高時(shí)也充分發(fā)揮抑菌活性。pH值在4～8的范圍內(nèi),覆盆子黃酮均能較好的抑制菌的生長(zhǎng),隨pH值的升高至9時(shí),覆盆子黃酮的抑菌活性有所減弱,細(xì)菌開始生長(zhǎng),但生長(zhǎng)趨勢(shì)弱于對(duì)照。因此,覆盆子黃酮不僅可以用于弱堿性食品,還可以用于酸性食品的儲(chǔ)藏保鮮。較其它化學(xué)防腐劑,應(yīng)用更廣泛。3合成微生物生長(zhǎng)黃酮類化學(xué)物具有可以破壞微生物細(xì)胞完整性,導(dǎo)致微生物細(xì)胞釋放胞內(nèi)成分