利用微衛星標記分析鯉雌核發育群體的遺傳結構

人工誘導魚類雌性發育是一種特殊的有性生殖方法，通過激活遺傳失活的精子來激活卵，并通過限制卵的極體或第一次卵裂來發展。人工雌核發育可以加快基因的純合進程,是一種快速建立純系的有效方法。并且在品種培育方面,能夠加快純化品系所需要的傳代周期,如吳清江等培育的全雌雜交鯉(CyprinuscarpioL.),吳端生等紅鯽近交系的建立,劉明華等在高寒鯉的培育,鄒曙明等團頭魴(Megalobramaamblycephala)良種雌核發育群體的建立,均通過雌核發育技術取得了很好效果,并縮短了選育時間。因此,開展魚類人工雌核發育研究,對于快速準確選育個體大、生長快和抗逆性強的優良品種具有重要意義。傳統的魚類雌核發育子代的純合度的鑒定,都依賴于表型、染色體技術去分析其后代的純合度。盡管所得雌核發育子代可證明是由雌核發育所獲得,但無法證明所獲雌核發育子代在基因座位上(特別是與經濟性狀相關的基因座位)表現為純合子還是雜合子。微衛星(Microsatellite)作為一種新的分子標記技術,已廣泛應用于分子標記連鎖圖譜的構建、基因定位、群體遺傳學研究和品種鑒定等領域,微衛星標記表現為共顯性標記,能夠鑒別純合基因型與雜合基因型,為遺傳背景調查提供準確及完整的遺傳信息。目前應用微衛星標記技術對魚類雌核發育群體的純度分析已有較多報道。本研究利用微衛星分子標記,對人工誘導分別獲得的抑制第一次有絲分裂和抑制第一次減數分裂的鯉雌核發育群體進行微衛星群體遺傳學研究,并通過微衛星座位分析2個雌核發育群體的雜合性,以探討2種雌核發育技術在鯉育種中的利用價值,為能快速獲得的鯉經濟品種純系提供有效的遺傳學依據。1材料和方法1.1抑制第一次有絲分裂鯉雌核發育群體的DNA樣品,均采自黑龍江水產研究所生物技術實驗室。在繁殖季節經人工催產,獲得鯉卵子和紅鯽精子,參照傳統的人工雌核發育的方法。抑制第一次有絲分裂是以經紫外線滅活的紅鯽精子與鯉的卵子受精,受精卵于23℃水族箱中進行孵化,用解剖鏡觀察以確定第一次卵裂時間(一般在30min左右),然后轉移到40℃的循環水浴中進行熱休克2min,即獲得通過抑制第一次卵裂而得到的第一個雌核發育家系。抑制減數分裂是以經紫外線照射過的紅鯽精子與鯉卵子受精5min后,轉移到0~4℃水中冷休克45min,抑制第二極體排除而獲得的第二個雌核發育家系。1.2edtapsh將剪取的約0.1g鰭條加入200μL裂解液(200μg/mL蛋白酶K;0.5%十二烷基肌氨酸鈉;500mmol/LEDTA,pH8.0;),55℃消化,中間不時地輕輕搖動,待組織完全消化后取出,用酚、氯仿、異戊醇(體積比為25∶24∶1)混合液抽提3次,加入RNA酶(終濃度為20μg/mL),37℃保溫30min,再用等體積的氯仿抽提1次,將基因組DNA進行數次透析,直至透析液OD270<0.05,無水乙醇沉淀,自然干燥后溶解于1/10TE中,4℃保存備用。1.3pcr擴增體系及程序PCR擴增反應總體積為25μL,其中包括DNA模板1μL(30~50ng/μL),10×PCRbuffer18μL(含Mg2+25mmol/L)1μL、dATP、dGTP、dTTP、dCTP各2mmol/L),上下游引物(10μmol/L)各0.5μL,TaqDNA聚合酶(上海生物工程公司)1U,加ddH2O補足體系。擴增反應均在PE9700型PCR(PE公司)上完成。反應程序為:94℃變性3min;94℃30s,50~55℃30s,72℃30s,38個循環;72℃延伸5min。引物序列及具體退火溫度情況見表1。1.4基因病毒成像擴增產物用3.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行分離,EB染色后用SYDR2/2062(美國基因有限公司)成像。DNA分子量Marker為Promega公司的100bpDNALadder。利用Gelpro軟件包(3.2版本)分析每個擴增條帶的大小,將不同大小的條帶作為基因座位的一個等位基因。1.5雜合位點比例的計算根據所得的基因型數據,利用Popgene(Version3.2)軟件統計微衛星基因座的等位基因頻率(AlleleFrequency,P)、等位基因數(Numberofalleles,A)、有效等位基因數(EffectiveNumbersofAllele,Ne)、觀測雜合度(HeterozygosityObserved,Ho)、期望雜合度(HeterozygosityExpected,He)。雜合位點比例,按照Slate&Pemberton(2002)的方法計算:個體雜合度=個體雜合位點數/個體總位點數。基因-著絲點的重組率(Recombinationrate,R)計算:R=(雜合個體數/總個體數)×100%。2結果與分析2.1微衛星標記pcr擴增對雌核發育的2個品系各隨機選擇15尾抽提基因組DNA,并選取13對具有高多態的微衛星標記進行擴增,擴增片段大小在105~350bp。圖1顯示,位點MFW14引物(片段大小為105bp、140bp)和位點HLJ071引物(片段大小為215bp、293bp)分別在2個雌核發育家系中擴增的電泳圖譜。2.2微衛星基因座的等位基因特征觀測雜合度是實際觀測到的雜合子在樣本中所占的比例,期望雜合度也稱基因多樣度,有效等位基因數目主要表示等位基因在群體分布的均勻程度。從表2的結果可以看出,所檢測的微衛星基因座位有1~3個等位基因,各基因座位等位基因頻率由0.056~1.000不等;其中抑制第一次有絲分裂的雌核發育群體的等位基因頻率為0.063~1.000,觀測雜合度的平均值為0.22,期望雜合度的平均值為0.24,平均有效等位基因數為1.41;抑制減數分裂的雌核發育群體的等位基因頻率為0.056~0.889,觀測雜合度的平均值為0.37,期望雜合度的平均值為0.47,平均有效等位基因數為1.93。2.3個微衛星位點的雜合度在13個位點中,除了HLJ109、HLJ044、HLJ172、HLJ034、MFW14和MFW26這6個位點在群體上均表現純合子外,其余7個微衛星位點均呈現不同程度的雜合,其中在位點MFW4上所有個體均表現為雜合子,且觀測雜合度大于期望雜合度。2.4雜合度大小對個體雜合度的影響13個位點在該家系的母本中均表現為雜合子。在該家系中,沒有發現完全純合的個體,其中在HLJ030、MFW23兩個位點全部以雜合子形式出現,且觀測雜合度大于期望雜合度。在所有雜合座位中,觀測雜合度最低的是位點MFW14,為0.11。2.5兩性核發育子代中出現的基因雜合和重組實驗設計在所分析的鯉抑制減數分裂雌核發育群體中,共有3個基因座位(HLJ034、HLJ044和HLJ071)與著絲粒有重組現象,重組率為20.00%,這表明雌核發育子代中出現的基因雜合,是卵母細胞在減數分裂過程中同源染色體之間發生了基因重組。統計結果見表3。3克氏原核的雜合及重組本研究所用的13對微衛星引物在2個雌核發育群體中都擴增目的片段,未出現無效等位基因現象。理論上抑制第一次卵裂而產生的鯉雌核發育群體,個體的基因型應是完全純合的;而抑制減數分裂而產生的群體,也可以得到純合度很高的近交系(個體基因純合率達60%~90%)。在本研究的13個微衛星座位中,抑制第一次卵裂而獲得的群體中僅6個座位表現為純合子,其余7個微衛星座位均呈現不同程度的雜合,其平均雜合度為0.22,其中在MFW4座位上,所有個體均為雜合子;在抑制減數分裂獲得的雌核發育子代中,沒有發現純合個體,其中HLJ030、MFW23等2個座位在所有個體上表現為雜合子,其平均雜合度為0.37。由于本實驗獲得的兩個雌核發育群體,都是用滅活的彩鯽精子受精,飼養一年后,在表型上未發現有鯉鯽雜交個體,因此認為所有子代都是經雌核發育而來。至于在雌核發育子代中出現雜合度高的原因可能是:第一,與鯉的多倍性有關,鯉是沒有完全二倍化的四倍體,是經多倍化后自然選擇演變而來,由于在減數分裂第一次分裂時同源染色體之間高重組和高交換過程,使雌核發育過程中加倍的四分體之一的雌性原核多數本身就是雜合的,再加倍也只能是雜合座位。何毛賢等在對合浦珠母貝3個群體同工酶研究中,三倍體的平均雜合度(0.286)大于二倍體的平均雜合度(0.255),也說明基因雜合度的高低與多倍性有關。第二,純合致死基因導致純合個體死亡,使得雜合子比例升高,由于雌核發育后的受精卵孵化率非常低,而經紫外滅活的精子,除殺死精子的DNA外,促進卵子發育的一些精子蛋白也被破壞,會使一些攜帶純合致死基因的胚胎在發育過程中逐漸死亡。第三,鯉受精卵發育具有受精卵發育不同步的現象,受精卵的第二極體排除這一時期發生在卵裂之前,對于抑制第一次卵裂的雌核發育來說,受精卵發育不同步導致在卵裂過程中部分卵子處于第二極體排除時期,使抑制第一次卵裂產生的雜合個體遠大于抑制第一次減數分裂產生的雜合個體,這也可能是在抑制第一次卵裂產生的雌核發育群體中,子代雜合位點過高的原因。重組是遺傳學的基本現象,在減數分裂染色體加倍過程中,同源染色體的同源部分發生聯會和交換,造成雌核發育子代出現基因的雜合現象。有關魚類雌核發育群體基因重組的報道中,重組率的變動范圍較大。如王曉清等采用6對大黃魚微衛星引物對2個大黃魚雌核發育家系進行微衛星標記分析時,發現在G1代有3個微衛星座位發生重組,重組率為12.5%,G2代有10個座位發生重組,重組率為41.7%;王偉等發現牙鲆異質雌核發育群體的4個微衛星座位發生重組,重組率為93%~100%;朱曉琛等發現牙鲆減數雌核發育二倍體的8個座位發生重組,平均重組率82.2%;Galbusera等發現非洲鯰有2個微衛星座位發生重組,重組率分別為86%和71%;Francescon等發現歐鱸在6個微衛星座位發生重組,重組率為40%~94%;Nagy等發現鯉的9個基因座位的平均重組率為35%;Thorgaard等發現虹鱒9個基因座位的平均重組率為55%;徐成等發現雌核發育牙鲆的Ldh和Cat兩個座位發生重組,重組率分別為52.6%和29.8%。本研究在所分析的鯉雌核發育群體中有3個微衛星座位發生重組,平均重組率為20%,較前面提到的其他魚類的重組率低。究其原因,可能是由于實驗中所擇位點離著絲粒較近,易受著絲點干擾;也可能與所操作的對象的基因組特性有關,導致本研究估算的重組率偏低。當然,要獲得準確的結論還需要進一步的調查和實驗的驗證。綜上所述,用鯉微衛星標記對抑制第一次卵裂而獲得的雌核發育子代的基因型進行檢測,發現基因位點的純合率為78%(雜合率為22%),實驗所得結果與理論值相差較大。所獲得的雌核發育子代只在少數微衛星座位上表現為純合,而在大部分座位上仍表現為雜合,因此若要直接建立純系還需要更多的共顯性遺傳標記對群體的純