超聲法制備熒光碳點及其在細胞成像中的應用

1熒光碳點的合成與二維石墨烯和二維碳納米管相比，零碳納米碳不僅具有尺寸優勢（uf0a310nm）、強的劑量限制和邊緣效應[2]4]，而且具有良好的亮度性能，引起了研究人員的關注。同時，碳點的化學陰性、耐光性和良好的生物兼容性可以應用于許多領域的生物化學、細胞成像、光電動力學等應用。然而,目前碳點的發展和應用依然處于初期探索階段.研究的內容主要集中在碳點的制備,期望通過簡單快速的方法合成具有優良發光性能的碳點[1,2,3,4,8,9,16,17,18,19].2006年,Sun等基于激光消融碳靶物的多步處理方法,得到發光性能較好的熒光碳納米粒子,并首次稱其為碳點(carbondots,CDs).之后,人們通過水熱氧化碳源法、激光消融法、電化學氧化法、微波法、高溫煅燒法、超聲合成法等制備出具有優良發光性能的碳點.盡管碳點的制備已經取得積極進展,包括應用各種經濟、綠色、環保的物質合成熒光碳點[16~18],但大部分合成方法依然操作復雜,且所合成碳點大多是藍色光致發光特性.而由于細胞具有較強的自發藍色熒光,因此將這些碳點用于細胞成像時不利于靶信號與背景信號的區分,背景干擾較大.綜上所述,非常有必要發展簡便合成其他顏色的碳點,特別是具有較長波長發光特性的碳點的方法,這樣在生物成像時能夠降低背景干擾,且減小激光對生物的損傷.本文以蠟燭灰為碳源,在強酸環境中通過超聲法一步合成黃綠色熒光碳點.合成方法簡單,原料便宜易得,所制備的碳點具有良好的穩定性、抗光漂白能力和生物相容性,能作為潛在的熒光標記探針進行細胞成像.2實驗部分2.1細胞毒性檢測試劑蠟燭購于西南大學教育超市;硫酸(H2SO4,98%)、硝酸(HNO3,37%)、丙三醇、氫氧化鈉(NaOH)均購于重慶川東化學試劑廠;cellcountingkit-8(CCK-8)細胞毒性檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司;多聚甲醛購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司;MEM培養基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶均購于美國Gibco公司.Britton-Robinson緩沖溶液用于調節碳點溶液的酸度;5mol/LNaCl儲備液用于調節溶液的離子強度;4.5mg/mL碳點儲備液存于4℃冰箱中.所有化學試劑均為分析純,實驗用水為超純水.2.2碳點的相關表征使用UV-3600紫外-可見分光光度計(日立公司,日本)、F-2500熒光分光光度計(日立公司,日本)和IRPrestige-21傅里葉變換紅外光譜儀(島津公司,日本)進行相關的光譜表征;使用ESCALAB250型X射線光電子能譜儀(美國熱電公司,美國)、LabRAMHR高分辨顯微拉曼光譜儀(HORIBAJobinYvon公司,法國)、TecnaiG2F20S-TWIN場發射透射電子顯微鏡(TEM,FEI公司,美國)進行碳點的相關性質表征;成像分析使用IX81LCS-DSU奧林巴斯轉盤共聚焦顯微鏡(奧林巴斯,日本),熒光成像時使用Cy-3通道發射濾光片,曝光時間100ms.實驗過程中還使用了H1650-W臺式微量高速離心機(湘儀離心機儀器有限公司,中國)、CoolSafe型冷凍干燥機(ScanVac,丹麥)、超聲波清洗機(上海比郎儀器有限公司,中國)、E-450數碼相機(尼康公司,日本)、QL-901旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司,中國)、pH510型酸度計(EUTECH儀器公司,新加坡)和EPOCH超微量全波長酶標儀(BioteckInstruments,美國)等儀器設備.2.3碳點溶液的制備使用潔凈的玻片在燭焰上方收集蠟燭灰,然后刮取約20mg蠟燭灰與20mL混酸(濃H2SO4:濃HNO3=3:1)于50mL比色管中混勻,得到黑色懸濁液.將其置于超聲儀中,60℃下超聲8h,放置過夜.接下來,將反應所得粗溶液離心除去大顆粒的未反應物,收集上清液,用飽和NaOH溶液調節pH至中性,再用0.22uf06dm濾膜過濾,得到黃褐色溶液.將溶液用透析袋(MWCO3500)于二次水中透析48h除去鈉鹽.透析后的溶液凍干,稱重并溶于二次水中,即得一定質量濃度的碳點溶液.2.4熒光共聚焦顯微成像使用cellcountingkit-8(CCK-8)試劑盒檢測細胞毒性.實驗中,首先用胰酶消化HeLa細胞,將其與MEM培養液配成一定濃度的細胞懸液,接種于96孔細胞培養板,置于細胞培養箱(37℃,5%CO2)中孵育24h.然后將細胞培養板中培養液吸出,PBS洗滌一次,加入新鮮MEM培養液,其中空白組每孔90uf06dL培養液和10uf06dLPBS緩沖液.實驗組每孔90uf06dL培養液和10uf06dL樣品(不同濃度的碳點溶液),繼續培養24h(37℃,5%CO2).取以上所得細胞培養板,吸出培養液,PBS洗滌兩次,然后每孔加入90uf06dL的PBS和10μL的CCK-8溶液,繼續孵育1h.最后,在酶標儀上測定細胞溶液在波長450nm處的吸光度,記錄并處理實驗結果.熒光共聚焦顯微鏡用于細胞成像時,將HeLa細胞接種于24孔細胞培養板,加入含有2%胎牛血清(FBS)的MEM培養液,孵育24h(37℃,5%CO2).然后吸出細胞培養板中培養液,PBS洗滌一次,再加270uf06dLMEM培養液(含2%FBS),30uf06dL樣品(0.5mg/mL碳點溶液),繼續孵育3h.最后,將以上所得細胞培養板棄去培養液,PBS洗滌三次,4%多聚甲醛固定30min,丙三醇封片,進行成像.3結果與討論3.1cds表面碳點表征通過TEM對碳點的形態進行表征.如圖1所示,所合成的碳點為球形和類球形,粒徑相對比較均勻,平均粒徑約3.5nm.該碳點極易溶于水,其溶液單分散性非常好,在紫外燈(uf06cex,365nm)光照下發射出肉眼可見的黃綠色熒光,顯示出優良的光致發光特性.為了進一步探索該碳點的發光性質,分別對其進行了吸收和熒光光譜掃描.如圖2(a)所示,碳點在紫外-可見區沒有特征吸收峰,這與間帶半導體材料的吸收性質一致;其熒光發射光譜隨著激發波長增加而逐漸紅移,呈現出多元激發、多元發射的光譜特性,這些特性與文獻報道相符,可能是由于CDs表面發光位點不同,以及制備過程中不均勻納米粒徑的量子尺寸效應等所造成的.為了進一步表征碳點的性質,測定了其紅外光譜、X射線光電子能譜(XPS)和拉曼光譜.圖3(a)出現了位于3425cm-1的羥基(–OH)伸縮振動吸收峰、飽和C–H伸縮振動峰(2924cm-1和2858cm-1)、羰基(C=O)伸縮振動吸收峰(1708cm-1)、碳碳雙鍵(C=C)伸縮振動吸收峰(1608cm-1及1400cm-1).特別需要指出的是,結合1708cm-1處C=O的吸收峰,3425cm-1處–OH較寬的吸收峰形,說明是羧酸(–COOH)上的–OH發生了彎曲振動.也就是說,CDs表面部分氧化成–OH,C=O以及–COOH.XPS測試結果顯示,碳點主要含有碳元素和氧元素(圖3(b)),而在C1s譜圖(見圖3(c))中有285.08,286.68,287.98,289.28eV四種信號峰,分別對應碳碳單鍵和雙鍵(C–C/C=C),烷氧基和環氧基或羥基碳(C–O/C–O–C/C–OH),羰基(C=O)和羧基(COOH).拉曼光譜(圖3(d))顯示,分別在1358cm-1和1580cm-1處出現兩個較強的D峰和G峰,表明存在sp3雜化碳原子和sp2雜化碳原子,此結果與紅外和XPS數據相符.以上數據表明,蠟燭灰前體在強氧化性混酸的腐蝕下,得到表面部分功能化的熒光碳點.3.2碳點聚集對熒光強度的影響首先,考察了不同pH對碳點熒光強度的影響.當溶液pHuf0a37.0時,碳點的熒光強度隨著溶液pH增大而線性增強,線性增強方程為F=119.4pH+351.9(n=6,r=0.99);而在pH>7.0的堿性條件下,碳點的熒光強度基本趨于穩定,如圖4所示.這可能是由于在酸性條件下,碳點表面的功能基團–OH和–COOH易發生氫鍵締合作用,碳點聚集從而導致熒光猝滅;在堿性條件下,則因為去質子作用,使羥基和羧基帶上負電荷,從而使碳點間因為靜電排斥作用保持單分散,其熒光較強.需要說明的是,在酸性條件下熒光強度隨pH增大線性增加,表明去質子化可能只發生在一種官能團上,要么是–OH、要么是–COOH.此外,該碳點具有優良的光穩定性及抗鹽能力,與文獻相符.研究表明,當碳點溶液中的氯化鈉濃度低于1.8mol/L時,碳點的熒光強度基本保持不變,說明該碳點具有很強的抗鹽能力,為碳點在生物方面的應用提供了保障.碳點溶液在300nm激發光條件下連續照射30min,其熒光強度基本沒有變化,說明所合成碳點非常穩定,幾乎沒有光漂白現象.3.3超聲熱或干吸熱有關碳點的發光機理還不清楚,目前仍處于推測階段.該反應體系中,碳點的制備是由蠟燭灰前體在強氧化性混酸的環境下,通過超聲過程所完成的.其中混酸不僅將蠟燭灰前體腐蝕為極小粒徑的碳納米粒子,同時還扮演了強氧化劑的重要角色.眾所周知,溶液在超聲的過程中由于產生交替的高壓波和低壓波,形成微小的氣泡,這些小氣泡在超聲場的作用下振動、生長并不斷聚集聲場能量,當能量達到某個閾值時,空化氣泡急劇崩潰閉合,這種“超聲空化”現象直接導致液體流的高速碰撞和強的流體剪力.因此,在超聲條件下,空化現象的產生導致混酸與蠟燭灰發生強烈碰撞,將其腐蝕并分裂為微小的碳納米粒子.所形成的碳納米粒子表面具有很多缺陷能帶,當用激發光照射時,由于其電子和空穴被量子限域(粒徑在1~10nm),連續的能帶結構變成具有分子特性的分立能級結構,受激后激子會發生輻射重組而發射熒光.3.4碳點用于細胞成像為了考察該碳點的生物相容性,本研究通過CCK-8實驗法對所合成的碳點進行了細胞毒性評價結果如圖5(a)所示.當碳點濃度低于3mg/mL時細胞存活率均在80%以上,表明該碳點具有較低的細胞毒性.除了具有優異的光穩定性、強的抗鹽能力和良好的生物相容性外,該碳點具有黃綠色光致發光的性質,這與細胞本身所具有的藍色自發熒光有顯著對比,將更有利于細胞成像中靶信號與背景信號的區分.基于此,本研究將該碳點進一步用于細胞成像.實驗發現,HeLa細胞具有微弱的背景熒光(圖5(c)),而將碳點與HeLa細胞共同孵育3h后,能夠觀察到較強的熒光信號(圖5(d)).因為其熒光量子產率較低(以硫酸奎寧為參照約為0.6%),所以成像效