長期低頻電刺激對7周齡大鼠廢用性肌萎縮的影響

廢除性肌腱痙攣主要是指身體在運動減少、剎車和喪失狀態(tài)下的生理、生化、形態(tài)和功能變化。許多臨床疾病（如癱瘓和肌肉痙攣）和治療措施（如骨骼固定）往往伴有運動減少和限制。目前,電刺激在臨床中應用非常廣泛,關于電刺激治療肌肉萎縮的機制和效果雖然還不完全清楚,但其安全性和有效性在臨床實踐的許多領域得到證實,如肌電生物反饋改善藥物吸收、電刺激鎮(zhèn)痛、肌肉控制運動和姿勢、促進慢性傷口愈合等［1-3］,相關研究也表明,電刺激可以興奮神經(jīng)肌肉組織,每個脈沖都有可能引起一次運動反應［4，5］。本文利用大鼠廢用性肌萎縮模型,探討電刺激對腓腸肌和比目魚肌萎縮肌肉的恢復效果及相關分子調(diào)控機制,為臨床應用提供實驗支持和依據(jù)。1材料和方法1.1動物分組、飼養(yǎng)采用改良式尾部懸吊法建立大鼠廢用性肌萎縮模型［6］。32只雄性6周齡SD大鼠購自上海斯萊克實驗動物中心,許可證號SCXK滬2009-0002。單籠飼養(yǎng),尾部懸吊,前肢著地,后肢懸空,身體長軸與水平面成30°角。動物在籠內(nèi)自由活動和進食飲水。飼養(yǎng)室溫度20~25℃。人工控制室內(nèi)照明,每天保證12小時光照,晝夜循環(huán)交替［7］。本實驗在南京醫(yī)科大學完成。大鼠分正常組、廢用性肌萎縮組、隔日電刺激組、每日電刺激組4組,每組8只。廢用性肌萎縮模型建立成功后,兩電刺激組每日1次或隔日1次電刺激大鼠腓腸肌和比目魚肌,刺激頻率30Hz,波寬200μs,可見被刺激部位肌肉明顯收縮,每次刺激30分鐘,持續(xù)30天。1.2組織切片制作電刺激結束后,32只大鼠立即經(jīng)戊巴比妥鈉(45mg/kg)腹腔麻醉后解剖,迅速取出右側后肢腓腸肌和比目魚肌,然后取中段約10mm,投入4%多聚甲醛固定,常規(guī)方法制作石蠟組織切片。進行mATPase組織化學染色法染色［8］,測量骨骼肌各型肌纖維(紅肌、中間肌及白肌)橫截面積。1.3abi實時熒光定量pcr檢測大鼠腓腸肌和比目魚肌勻漿后,采用Trizol方法提取總RNA,經(jīng)反轉錄合成cDNA,經(jīng)realtime-PCR,測定I、IIa、IIx、IIb的相對表達量,其引物(上海生工)序列如下:I:引物序列,上游:5’-GGAGCTCACCTACCAGACAGA-3’;下游:5’-CTCAGGGCTTCACAGGCATCC-3’,擴增片段長度308,基因銀行序列NM_017240.1。IIa:引物序列,上游:5’-CCTCTTACTTCCCAGCTGCACCTTCT-3’;下游:5’-CTCAGGGCTTCACAGGCATCC-3’,擴增片段長度239,基因銀行序列NM_001135157.1。IIx:引物序列,上游:5’-ACGGTCGAAGTTGCATCCCTAAAG-3’;下游:5’-CACCTTCGGTCTTGGCTGTCAC-3’,擴增片段長度263,基因銀行序列NM_001135158.1。IIb:引物序列,上游:5’-AGCCTGCCTCCTTCTTCATCTGG-3’;下游:5’-CACGGTTGCTTTCACATAGGACTC-3’,擴增片段長度229,基因銀行序列NM_019325.1。β-actin:引物序列,上游:5’-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3’;下游:5’-CCCATACCCACCATCACACC-3’,擴增片段長度207,基因銀行序列NM_031144.2。反應體系為20μl,包含2μlcDNA模板(1μgμl),0.4μl引物(10nM),10μlSYBRgreenI,7.2μ超純水。擴增條件:94℃預變性10秒,93℃變性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸30秒,共40個循環(huán)。反應在ABI實時熒光定量PCR儀(ABICo,USA)上進行,72℃~95℃緩慢升溫,產(chǎn)生相應指標的溶解曲線,重復檢測2次。以β-actin為內(nèi)參。1.4免疫組化法檢測matase的表達肌肉組織勻漿后,提取蛋白,BCA法定量,分裝并保存于-80℃,備用。蛋白98℃變性5分鐘,進行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,60V濃縮膠,120V分離膠,2.5~3小時。電泳后取下膠,按尺寸剪取合適大小的Whatmann濾紙及硝酸纖維素膜,采用半干式轉膜,恒壓20V,時間為膜面積乘以系數(shù)1.6,轉移蛋白到硝酸纖維素膜。1%BSA,37℃封閉1小時。加入PBST稀釋至工作液濃度的p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK1/2、p-ERK1/2、β-actin一抗(南京凱基生物),37℃孵育1~2小時。再加入用PBST稀釋二抗至工作液濃度,37℃避光孵育1h。反應結束后棄二抗,用PBST清洗,采用Odyssey近紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司產(chǎn)品)掃膜。采用MoticImagesplus2.0彩色圖像分析系統(tǒng)對肌纖維組織化學和免疫組化學結果進行計數(shù)。每例動物隨機抽取3張接近肌腹中部的肌肉組織切片,每張切片在200倍光鏡下隨機觀測5個視野,根據(jù)mATPase染色強度確認呈陰性的為Ⅰ型肌纖維,呈陽性的則為Ⅱ型肌纖維,分別計數(shù)每個視野內(nèi)的不同類型肌纖維。計算每組動物不同類型肌纖維數(shù)量,再求其在所有肌纖維中的比例。1.5實驗數(shù)據(jù)的正交弦變換采用SPSS16.0軟件統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù),所有百分比數(shù)據(jù)進行反正弦變換,所有實驗數(shù)據(jù)均以(均數(shù)±標準差)表示,方差齊時,組間比較采用方差分析,方差不齊時用秩和檢驗,以0.05作為顯著性差異界值。2結果2.1兩組大鼠小鼠材料i型肌纖維的電刺激試驗表1顯示,廢用性萎縮組大鼠腓腸肌I型肌纖維比例較正常組降低了29.94%,II型肌纖維比例增加了7.33%,均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在比目魚肌觀察到同樣的結果,廢用性萎縮組I型肌纖維比例較正常組降低了18.73%,同時II型肌纖維比例增加了52.02%,均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。只比較I型肌纖維,兩電刺激組大鼠腓腸肌和比目魚肌I型肌纖維比例較廢用性萎縮組升高明顯。隔日電刺激組腓腸肌I型肌纖維比例較廢用性肌萎縮組升高了13.35%,每日電刺激組升高了34.68%,均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隔日電刺激組比目魚肌I型肌纖維比例較廢用性肌萎縮組升高了8.97%,每日電刺激組升高了19.00%,均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。只比較II型肌纖維,隔日電刺激組和每日電刺激組大鼠腓腸肌和比目魚肌II型肌纖維比例較廢用萎縮組減少明顯。隔日電刺激組腓腸肌II型肌纖維比例較廢用性肌萎縮組減少了0.97%,每日電刺激組較廢用性肌萎縮組減少了4.38%,均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隔日電刺激組比目魚肌II型肌纖維比例較廢用性肌萎縮組減少了13.32%,每日電刺激組較廢用性肌萎縮組減少了28.23%,均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。每日電刺激組肌纖維比例改變效果大于隔日刺激組,I型和II型肌纖維比例與廢用性萎縮組比較均有顯著性差異(P<0.05)。2.2大鼠mhcmrna表達變化表2可見,廢用性肌萎縮組的腓腸肌I型MHCmRNA表達比正常組下降16%,與正常組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),廢用性肌萎縮組的腓腸肌IIa、IIx、IIb型MHCmRNA表達比正常組升高2%、6%和23%,其中IIb升高明顯,與正常組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。廢用性肌萎縮組比目魚肌I型MHCmRNA表達較正常組下降32%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),廢用性肌萎縮組比目魚肌IIa和IIx型MHCmRNA表達較正常組分別升高5%和33%,其中IIx型升高有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。每日電刺激組和隔日電刺激組大鼠腓腸肌和比目魚肌I型MHCmRNA表達較廢用性萎縮組明顯升高,有顯著性差異(P<0.05),且每日刺激組恢復較隔日刺激組明顯。每日電刺激組和隔日電刺激組大鼠腓腸肌和比目魚肌II型(IIa、IIx、IIb)MHCmRNA表達較廢用性萎縮組有升有降,變化不統(tǒng)一。2.3開放肌有利于pahss表達,最終表達p-erk1/2和p-3g采用灰度掃描儀(CEPathspeedCRMP310)對腓腸肌和比目魚肌肌纖維蛋白表達(圖1)進行灰度掃描。結果顯示,電刺激組腓腸肌和比目魚肌肌纖維MAPK相關激酶蛋白表達與廢用性肌萎縮組相比均有明顯變化。正常組腓腸肌p-JNK表達是廢用性肌萎縮組的3.4倍,p-ERK1/2是2.48倍,p-p38是2.75倍;隔日電刺激組腓腸肌肌纖維p-JNK表達是廢用性肌萎縮組的2.66倍,p-ERK1/2是1.91倍,p-p38是2.37倍;每日電刺激組p-JNK表達是廢用性肌萎縮組的2.93倍,p-ERK1/2是3.57倍,p-p38是3.31倍。正常組比目魚肌肌纖維p-JNK表達是廢用性肌萎縮組的3.17倍,p-ERK1/2是1.44倍,p-p38是1.7倍;隔日電刺激組比目魚肌肌纖維p-JNK表達是廢用性肌萎縮組的4.25倍,p-ERK1/2是2.34倍,p-p38是1.77倍;每日電刺激組比目魚肌肌纖維p-JNK表達是廢用性肌萎縮組的4.66倍,p-ERK1/2是3.07倍,p-p38是1.95倍。3電刺激對肌纖維基因表達的影響在廢用性肌萎縮中,骨骼肌纖維由Ⅰ型肌纖維向Ⅱ型肌纖維轉化［9］。大鼠骨骼肌肌球蛋白重鏈(MHC)基因表達的路線為:Ⅰ→Ⅱa→Ⅱx→Ⅱ［10，11］。本實驗再次驗證了此過程。腓腸肌外側主要以快肌纖維為主,纖維構成比例約為I型20%,IIa型20%,IIx型10%,IIb型最多,約50%。而與此對比,比目魚肌以慢肌纖維為主,未發(fā)現(xiàn)IIb型肌纖維［12］,I型約占70%,IIa型20%,IIx型10%。骨骼肌萎縮后,無論以白肌為主的腓腸肌還是以紅肌為主的比目魚肌,I型肌纖維基因表達減少,IIa、IIx、IIb型肌纖維基因表達增多,I型肌纖維向II型肌纖維轉變。本實驗中,無論每日刺激組還是隔日刺激組,30天電刺激均能減少肌纖維類型的轉變幅度,I、IIx、IIb型的轉變幅度均減少,但IIa型表達較萎縮組增加。兩組電刺激比較,每日刺激組較隔日刺激組效果更明顯。以紅肌為主的比目魚肌I型肌纖維基因表達下降更明顯,可能是比目魚肌紅肌比重大,萎縮對紅肌基因表達影響更大的結果。文獻報道,激烈運動激活MAPK相關激酶通路［13-15］。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated-proteinkinases,MAPKs)是一類主要的信號分子,是哺乳動物細胞內(nèi)廣泛存在的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶。目前,至少鑒定出了4種MAPK家族成員,分別為細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2),c-JunN端激酶(JNK)/應激活化蛋白激酶(SAPK),p38及ERK［16，17］。每種MAPK被特異的MAPK激酶(MAPKK,MEK)激活,后者又被MAPKK激酶(MAPKKK,MEKK)激活,MAPK信號通路正是通過這種保守的三級酶促級聯(lián)反應激活其下游轉錄因子,MAPK是該信號通路的樞紐［18］。在骨骼肌纖維中,激活的MAPK通過磷酸化核轉錄因子、細胞骨架蛋白及酶類等,參與骨骼肌細胞增殖、生長、發(fā)育、分裂以及各種肌細胞類型轉化等多種生理和生化反應［19］。本實驗發(fā)現(xiàn),廢用性肌萎縮的肌纖維細胞中磷酸化JNK、ERK1/2、p38蛋白表達明顯低于正常組。當隔日電刺激兩種肌纖維后,磷酸化JNK、ERK1/2、p38蛋白上調(diào),每日電