五種瘤胃微生物基因組dna提取方法比較

腫瘤微生態是一種復雜的生態系統，由大量的古細菌、真菌、真菌和原生動物組成。這一系統是世界上纖維原生動物轉化使用最有效的自然系統之一。瘤胃微生物的生長代謝活動能夠為宿主動物提供能量,蛋白質,氨基酸和維生素等營養物質,是研究反芻動物營養代謝的關鍵。但是由于瘤胃微生物數量巨大,種類繁多,且絕大多數是嚴格厭氧或兼性厭氧,體外培養困難,再加上大量不可培養微生物的存在,采用傳統培養技術已經很難對瘤胃微生物進行更加全面而深入的認識。近年來,隨著現代分子生物學的發展,為瘤胃微生物的研究提供了新的技術和手段,特別是微生物rDNA分子生物技術為瘤胃微生物的評價開辟了新的途徑。能提取出環境微生物中的總DNA就可以對復雜的微生物系統進行大量系統的研究,還可以用于檢測不可培養的微生物,跟蹤某些目標菌株在自然環境中的行為,也可用來揭示微環境中基因多樣性及其隨環境變化的特征。目前國內外對環境微生物樣品如土壤,海洋,淤泥,垃圾等進行rDNA序列和分析序列系統發展及多樣性研究已有大量報道,其中不乏有關通過免培養技術對瘤胃微生態的研究報道,如ChristopherMcSweeney,RoderickMackie,王遠亮等,提出了多種提取瘤胃微生物DNA的方法,但是將這些方法進行系統比較的研究較少,而獲得有代表性的瘤胃微生物DNA將有助于研究瘤胃中微生物區系隨環境的動態變化及其多樣性,本試驗以此為出發點摸索瘤胃微生物基因組DNA的提取方法,為后續分子生物學研究提供質量和純度較高的樣本DNA。1材料和方法1.1材料表面瘤胃內容物來自于安裝有永久性瘤胃瘺管的蒙古綿羊。1.2樣品的預處理參見文獻中樣品處理方法。1.3提取的dna1.3.1菌體沉淀液的制備取100μL1.3中處理過的樣品,用9倍體積生理鹽水洗滌2次,獲得菌體沉淀。以下各方法所用菌液均來自于同一樣本,取樣量均為100μL。1.3.2提取各組dna選取國內外常用的五種提取微生物基因組DNA方法,分別提取1.3.1中收集的菌體沉淀中微生物DNA。(1)水煮法參照文獻中DNA提取方法,略做改進,加入溶菌酶37℃消化1h。(2)溶解酶sds-苯酚或氯仿法參照文獻中DNA提取方法。(3)經典苯酚法參照文獻中DNA提取方法。(4)氯化氯仿法照文獻中DNA提取方法。(5)飽和酚/氯-異戊醇的制備參照文獻中DNA提取方法,經修改后具體步驟如下:菌體沉淀中加500μL分離緩沖液(100mmol/LTris-HClpH8.0,50mmol/LEDTA,0.1%SDS,200μg/mL蛋白酶K),使菌體充分懸浮,加入0.5g玻璃微珠(TIANGEN公司,200-400目),漩渦振蕩器上震蕩3min,再加入10μLβ-巰基已醇,1%(g/V)PVP(聚乙烯基吡咯烷酮),50℃消化1h,期間不斷混勻;加入65μL10%(g/V)CTAB(十六烷基三甲基溴化銨),120μLNaCl,混勻,55~65℃水浴3h或過夜消化;用等體積的飽和酚/氯仿/異戊醇,氯仿/異戊醇各抽提1次,取上清液加入等體積的異丙醇和1/10體積的3mol/LNaAC,冰上放置15min,12000r/min,4℃,離心10min;70%乙醇洗滌2次,晾干,加入100μL1×TE,加入適量Rnase,37℃處理30min,4℃備用。1.4含量、純度和電泳試驗用紫外可見分光光度計(Eppendorf)測定各DNA濃度和純度,0.8%瓊脂糖凝膠電泳DNA,拍照觀察。1.5粗提dna的純化采用TIANGEN公司的DNA產物純化試劑盒對1.3中5種方法粗提的DNA進行純化,DNA純化后溶于分別100μL無菌ddH2O,供DNA含量和純度的測定以及作PCR擴增的模板。1.6對dna質量的檢測1.6.1pcr檢測驅動下的3dna片段通過1.4中對各方法提取的DNA含量、純度和電泳檢測結果,選取其中較優的方法,以此方法提取的DNA為模板,純化后擴增瘤胃古細菌,真細菌和真菌16/18SrDNA片斷,以檢測DNA的質量和完整性。各個體系設3個重復,所用引物序列見表1。其中真細菌的引物為FP27,EUB338。PCR反應體系(20μL):2×premixExTaq預混液10μL,10μmol/L的引物各0.8μL,模板(瘤胃微生物總DNA)5μL,ddH2O3.4μL。PCR反應參數:94℃變性4min;95℃40s,51~61℃1min,72℃1.5min;共35個循環;72℃7min。1.6.2srdna片段的pcr擴增纖維降解菌為瘤胃降解粗纖維的主要功能菌,以1.4中篩選出的較優方法提取的DNA為模板,擴增3種主要的纖維降解菌Fibrobactersuccinogenes、Ruminococcusflavefaciens、Ruminococcusalbus的16SrDNA片斷,以進一步檢測該DNA的全面性。各個體系設3個重復,PCR反應體系、和參數同1.6.1,擴增產物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測觀察,拍照。所用引物序列見表2。2結果與分析2.1種方法所提取dna的純度和純度反芻動物瘤胃內容物成分復雜,含有龐大的微生物種群,以及飼料殘渣,動物消化道脫落細胞和許多不明生物物質,使粗提得到的DNA含有非常多的雜質。由于瘤胃液中色素、酚與多糖含量高,本身呈黃色,粗提的DNA也略帶黃色。圖1為5種方法粗提DNA電泳結果,其中溶菌酶-水煮法條帶不清楚,且亮度不夠,說明這種方法很難裂解復雜的瘤胃微生物細胞,不適合用來提取瘤胃微生物總DNA。而溶菌酶-SDS-酚/氯仿法、經典酚/氯仿法、氯化芐法和珠磨-SDS/CTAB/PVP法均有條帶出現,片段長度在20kb以上,但電泳膠孔中含有多糖和大分子不明物質,并且有拖尾現象。表3所示為用紫外可見分光光度計測定各DNA濃度和純度,進一步檢測1.4中5種方法粗提DNA的含量與純度。由表中結果可以看出5種方法所提取的瘤胃微生物DNA純度和含量均有顯著差異,其中改進后得珠磨-SDS/CTAB法提取DNA的純度和含量均居5種方法之首。圖2是將圖1中出現條帶的粗提DNA進行純化的結果,可見溶菌酶-SDS-酚/氯仿法粗提的DNA經純化后條代亮度明顯降低,而珠磨-SDS/CTAB/PVP法,氯化芐法,經典酚/氯仿法各個泳道的DNA條帶集中、清晰,膠孔都很干凈。經過純化后的DNA沉淀顏色較白,說明色素等有色雜質被去除。用紫外可見分光光度計測得OD260/OD280達到1.8以上。較純化前條帶亮度均略有下降,原因可能是粗提DNA中含有許多DNA小片段或殘留RNA片斷,在純化過程中被除去;另外純化試劑盒回收效率無法達到100%(試劑盒中說明回收效率在80%以上)。綜合以上5種方法,珠磨-SDS/CTAB/PVP法提取得到的DNA樣本純度以及得率都居5種方法之首,優于其他4種方法,所以本試驗初步確定珠磨-SDS/CTAB/PVP法為提取綿羊瘤胃微生物基因組DNA最優方法,為了證明這種方法的適用性,又對此DNA質量進行了分子生物學手段檢測。2.2菌株鑒定及pcr擴增結果圖3為以珠磨-SDS/CTAB/PVP法提取的DNA為模板,擴增綿羊瘤胃古細菌,真細菌和真菌16/18SrDNA片斷。由圖可見以珠磨-SDS/CTAB/PVP法提取獲得的DNA為模板分別擴增瘤胃古細菌、真細菌和真菌都能獲得較理想的結果,真細菌預計所擴增片段為331bp,其PCR擴增結果在300~400bp之間出現條帶;古細菌預計所擴增片段為910bp,其PCR擴增結果在900~1000bp之間出現條帶;真菌預計所擴增片段為785bp,其PCR擴增結果在700~800bp之間出現條帶。以上3種菌的擴增結果都與原目標片段相符,且擴增結果穩定,重現性較好。圖4為珠磨-SDS/CTAB/PVP法提取的DNA為模板,擴增瘤胃3種纖維降解菌的16SrDNA,Fibrobactersuccinogenes預計所擴增片段為446bp,其PCR擴增結果在400~500bp之間出現條帶;Ruminococcusflavefaciens預計所擴增片段為173bp,其PCR擴增結果在100~200bp之間出現條帶;Ruminococcusalbus預計所擴增片段為178bp,其PCR擴增結果在100~200bp之間出現條帶以上3種菌的擴增結果都與原目標片段相符,且擴增結果穩定,重現性較好。以上分子生物學手段檢測結果說明利用珠磨-SDS/CTAB/PVP法可以得到瘤胃微生態中絕大部分微生物的基因組DNA。粗DNA純化后,可以滿足PCR分子生物學操作的要求。3pcr擴增的效果分析由于瘤胃內環境及其中微生物的復雜性,目前還缺少選擇性培養基,常規傳統分析微生物的方法受到了極大的限制。鑒于此原因國內外研究者都紛紛避開了傳統培養而直接從瘤胃內容物中提取微生物DNA,利用免培養技術研究瘤胃微生態,如王遠亮采用未培養技術對荷斯坦奶牛瘤胃細菌多樣性進行初步研究;TajimaK通過16SrDNA序列分析瘤胃細菌區系等。本研究選取了5個實驗室常用提取微生物DNA的方法進行了比較,并對其中有的方法做了一定改進,得出珠磨-SDS/CTAB/PVP法所提取得到的DNA在純度和濃度上都優于其它幾種方法,粗提DNA產量達(851.78±9.86)μg/mL,OD260/OD280在1.7左右;PCR擴增古細菌、真細菌和真菌16/18SrDNA片斷均得到了預期的效果,擴增結果穩定,重現性較好;限制性內切酶分析也得到了較為理想的效果。分析其原因可能在于對細胞裂解的差異,在提取DNA過程中,細胞裂解是非常重要的環節,因細胞結構及所含成分不同,樣品細胞裂解也有所不同。SDS法一般適用于血液,細胞,動物組織,細菌,酵母等;CTAB法和氯化芐適用于植物組織,真菌等;此外還有物理方式,化學方式和酶法,主要針對一些細胞壁結構復雜,難于裂解的樣品。反芻動物瘤胃內容物微生物種群含有大量革蘭氏陰性菌,革蘭氏陽性菌,真菌及其游動孢子等微生物,使得細胞破壁顯得更加關鍵。本研究得出采用珠磨-SDS/CTAB法提取獲得的瘤胃微生物總DNA結果較好,該方法鑒于有些瘤胃微生物細胞壁結構特殊且較難裂解,以玻璃珠機械破壁為主,使用CTAB與SDS相結合來裂解消化細胞,兼顧大多數瘤胃微生物特性,混合DNA中包含了各種古細菌、真細菌和真菌的基因組DNA。另外裂解過程中加入了β-巰基乙醇和PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)來排除酚等次生干擾物質,緩解褐色沉淀。一般而言來自環境中的樣品含有非常復雜的成分,瘤胃微生物樣品中也存在同樣問題。粗提DNA中大量雜質直接影響后續的分子生物學操作,如PCR,核酸雜交,內切酶消化等,所以瘤胃微生物中提取的DNA樣品也需要進行純化。本