第三章

病毒和亞病毒天花smallpoxSmallpoxvirionSmallpoxvirusstructureEdwardJenner1749-1822，English愛德華·琴納琴納發(fā)明牛痘苗（一種與天花病毒有交叉抗原的疫苗）1796年5月17日接種獲得成功

Rabiesvirusparticles狂犬病毒顆粒郁金香雜色花與正常花感染煙草感染蘭花病毒的發(fā)現(xiàn)

1892：俄國伊萬諾夫斯基Ivanowski首次發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒的感染因子能通過細菌過濾器。1898：荷蘭貝哲林克Beijerinck證實該致病因子可以被乙醇從懸液中沉淀下來而不失去其感染性但用培養(yǎng)細菌的方法培養(yǎng)不出來；給這樣的病原體起名叫virus。1935：美國斯壇萊從煙草花葉病病葉中提取出了病毒結(jié)晶，又證實了結(jié)晶中含核酸和蛋白質(zhì)兩種成分，而只有核酸具感染和復(fù)制能力，并因此獲得諾貝爾獎。1952：Hershey和Chase證實噬菌體的遺傳物質(zhì)僅僅是DNA,開創(chuàng)了病毒分子生物學(xué)。1971后：陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了各種亞病毒——類病毒、朊病毒和擬病毒。第一節(jié)病毒第二節(jié)亞病毒第一節(jié)病毒

一、概述1、病毒的概念、特點：一類超微的、專性活細胞寄生、不具細胞結(jié)構(gòu)的微生物，其本質(zhì)是一種只含有DNA或RNA的特殊遺傳因子。個體微小，專性活細胞寄生的大分子微生物，由核酸和pro組成。非細胞生物真病毒：至少含有核酸和蛋白質(zhì)兩種組分亞病毒：類病毒：只含具單獨侵染性的RNA組分擬病毒：只含不具單獨侵染性的RNA

組分朊病毒：只含蛋白質(zhì)一種組分1995年報告了4000余種病毒，劃歸為49個病毒科.分類：宿主、所致疾病、核酸種類等病毒的分類依據(jù)宿主范圍植物病毒動物病毒（人、脊椎動物、昆蟲）

微生物病毒（真菌、藻類、原生動物、細菌、放線菌、藍細菌）

噬菌體是感染細菌和放線菌的病毒。2病毒的存在狀態(tài)感染態(tài)：活細胞內(nèi)專性寄生，V一般不含酶系或酶系極不完全，不能獨立進行代謝活動，只能在特定的活宿主細胞里，利用宿主cell酶進行復(fù)制和增殖。非感染態(tài):在離體條件下，V能以無生命的生物大分子狀態(tài)長期存在，并可長期保持其侵染活性。3、病毒的特點形體極其微小，必須在電子顯微鏡下才能觀察，一般都可通過細菌濾器沒有細胞構(gòu)造，其主要成分僅是核酸和蛋白質(zhì)兩種，故也稱分子生物每一種病毒只含有一種核酸，不是DNA就是RNA既無產(chǎn)能酶系也無蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，在宿主細胞協(xié)助下，通過核酸的復(fù)制和核酸蛋白裝配的形式進行增殖，不存在個體生長和二均等分裂等細胞繁殖方式在宿主的活細胞內(nèi)營專性寄生在離體條件下，以無生命的化學(xué)大分子狀態(tài)存在，并可形成結(jié)晶對一般抗生素不敏感，但對干擾素敏感可整合與宿主基因，誘發(fā)潛伏性疾病4、細胞經(jīng)病毒感染呈現(xiàn)不同反應(yīng)細胞無任何明顯變化由于病毒的致細胞病變效應(yīng)，導(dǎo)致細胞損傷、死亡細胞增生，繼而細胞死亡，細胞繼續(xù)失去生長控制，轉(zhuǎn)化為癌細胞—乳頭瘤病毒5、病毒的分布人類、昆蟲、真菌、細菌疾病發(fā)酵環(huán)境保護：利用藻類病毒消除水面藻類污染有害生物控制：害蟲、真菌及雜草控制花卉增色：金邊瑞香、雜色郁金香等金邊瑞香二、病毒的形態(tài)與大小（一）病毒的大小：用nm表示，大小差異較大，絕大多數(shù)病毒是能通過細菌濾器的微小顆粒，多數(shù)病毒粒子的直徑在100nm上下。小的病毒，植物的雙粒病毒直徑18-20nm，口蹄疫病毒21nm,脊髓灰質(zhì)炎病毒，小28nm。研究方法：電鏡、電泳、超離、超濾、X線衍射大的病毒，動物的痘V大小300～450×170～260，，鼻病毒150nm

（二）病毒的形態(tài)基本形態(tài)：球形顆粒、桿狀顆粒、子彈狀、復(fù)雜形狀顆粒球形病毒、卵球形病毒------動物病毒桿狀病毒或絲狀--------------植物病毒蝌蚪形病毒------------------細菌病毒的形態(tài)脊髓灰質(zhì)炎病毒腺病毒皰疹病毒天花病毒天花病毒痘病毒TMV煙草花葉病毒Rabiesvirusparticles皰疹性口炎病毒T4噬菌體1、典型病毒粒的構(gòu)造病毒粒子（病毒粒或病毒體）：指成熟的、結(jié)構(gòu)完整的、有感染性的單個病毒。基本構(gòu)造核衣殼：核心（基因組）、衣殼非基本構(gòu)造包膜、刺突

核酸:核心，核酸是病毒粒子中最重要的成分，它是病毒遺傳信息的載體和傳遞體，因此是病毒生命活動的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。病毒核酸的類型很多，它為病毒的分類提供了可靠的分子基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)：衣殼（支架、抗原、保護、侵嗜性）衣殼粒核衣殼：核心和衣殼的合稱，任何“真病毒”都有包膜：類脂雙層含蛋白質(zhì)或糖蛋白，包膜病毒、裸露病毒刺突:包膜上的附屬物核心：核酸→基因組genome→決定病毒遺傳、變異和復(fù)制殼粒capsomere→衣殼capsid→保護、介導(dǎo)、抗原性包膜envelope，包膜子粒peplomere（刺突spike）→保護、介導(dǎo)、抗原性腺病毒有包膜及無包膜病毒2、病毒粒子的對稱體制由相同的蛋白質(zhì)亞基----衣殼粒裝配而成的病毒粒子，通常只形成螺旋對稱和二十面對稱兩種體制。螺旋對稱：能使核酸與蛋白質(zhì)亞基間的接觸更為緊密，衣殼粒沿核酸鏈排列二十面對稱：特別有利于核酸分子以高度卷曲的形式包裹在小體積的衣殼中，每面為等邊三角形。二十面對稱結(jié)構(gòu)衣殼最堅固，內(nèi)部空間最大。復(fù)合對稱：其衣殼的特點無非是螺旋對稱和二十面對稱相結(jié)合而已，故稱復(fù)合對稱。谷氨酸發(fā)酵中所發(fā)現(xiàn)的噬菌體E.coli的T偶數(shù)系列噬菌體3、病毒的群體形態(tài)包涵體病毒感染寄主后與寄主的細胞蛋白合成一種在光學(xué)顯微鏡下可見的顆粒體。

有的在細胞核（皰疹病毒），有的在細胞核、細胞質(zhì)都有（麻疹病毒）皰疹包涵體、顧氏小體（天花）、內(nèi)基氏小體（狂犬病V）有的的細胞質(zhì)（狂犬病毒）噬菌斑（plaque）少量烈性噬菌體與大量敏感細胞混合后，涂布在培養(yǎng)基平板上，一定溫度下培養(yǎng)10-20h后，可見到嗜菌的透明小圓斑，為噬菌斑，直徑1-3mm左右——負菌落（在菌苔上）。噬菌斑大小、邊緣和透明度，故可用作鑒定的指標，也可利用噬菌體斑進行純種分離和記數(shù)。以單層動物細胞受動物病毒侵染產(chǎn)生的透明斑為空斑，死細胞群落。動物細胞受腫瘤病毒感染后細胞劇增形成的病灶病斑。植物葉片上的植物病毒群體為枯斑。病毒群體利于對其分離、純化、鑒定和計數(shù)。枯斑（三）三類典型形態(tài)的病毒

1.螺旋對稱的代表----煙草花葉病毒(TMV)

病毒表面的衣殼粒有規(guī)律地螺旋排列，形成一中空柱，核酸（ssRNA）位于衣殼內(nèi)側(cè)螺旋狀溝內(nèi)。外形直桿狀，300×15nm，內(nèi)徑4nm，95％衣殼，5％ssRNA（6390）衣殼含2130個衣殼粒TMV給煙草帶來極大的危害煙草花葉病毒2.二十面體對稱的代表---腺病毒（Adenovirus)腺病毒252個衣殼粒，排成二十面體結(jié)構(gòu)，核酸位于中心，無包膜，d＝70－80nm，12角，20面，30棱，刺突在五鄰體頂角上，dsDNA（36500bp）多瘤病毒72個衣殼粒；脊髓灰質(zhì)炎病毒32個衣殼粒。3.復(fù)合對稱代表---T偶數(shù)噬菌體T4噬菌體λ-噬菌體噬菌體侵染大腸桿菌（四）病毒的核酸和蛋白質(zhì)

1、病毒的核酸：種類：DNA，RNA;dsss;線狀，環(huán)狀：閉環(huán)，缺口環(huán)一種病毒只含有一種核酸ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA類型。經(jīng)誘變劑處理的病毒核酸可使病毒變異；除去蛋白外殼的核酸（感染性核酸），其感染范圍比完整的病毒廣泛，但感染力低，是1/1000～1/10000。動物病毒-----有些是DNA，有些是RNA(dsss)植物病毒--------大部分是RNA(dsss)噬菌體----------大部分是DNA（dsss）藻類病毒--------雙鏈DNA不同病毒的核酸含量差別較大，5%---50%2、病毒的蛋白質(zhì)病毒的蛋白質(zhì)分為結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白：有感染性的病毒所必需非結(jié)構(gòu)蛋白：病毒復(fù)制所需的蛋白一些簡單病毒僅由一種或幾種蛋白質(zhì)構(gòu)成，一些復(fù)雜的可多達20余種。蛋白質(zhì)的功能主要是構(gòu)成病毒粒子的外殼，保護病毒核酸；決定病毒感染的特異性，與宿主受體特異親和，促使吸附；具有抗原性，能刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體；構(gòu)成病毒酶，分解酶、合成酶等

3、其他成分有包膜的病毒還有脂類和糖類病毒的脂類存在于包膜中，來源于宿主細胞，50-60%為磷脂，余下為膽固醇，構(gòu)成脂雙層結(jié)構(gòu)

病毒的糖類主要有葡萄糖、龍膽二糖、巖藻糖、半乳糖等，一趟蛋白形式存在于包膜表面，與病毒的抗原性相關(guān)三．理化因素對病毒的影響滅活：病毒受理化因素作用后，喪失感染性，滅活V保留其他生物學(xué)特性，如抗原性、紅細胞吸附、血凝及細胞融合等滅活病毒可能被破壞核酸或蛋白、脂類等（一）物理因素影響1、溫度V耐冷不耐熱，室溫存活時間短，56度30min，100度幾秒滅活乙肝病毒HBV耐受60℃4h，100℃10min熱是蛋白變性，破壞酶；2、射線電離輻射與UV滅活病毒，劑量大于細菌，其破壞病毒核酸結(jié)構(gòu)，但保留免疫原性有些病毒具光復(fù)活特性，不能用UV滅活制備疫苗3、干燥常溫干燥易滅活，冷凍真空干燥可長期保存，用此技術(shù)制備疫苗4、酸堿度多數(shù)在pH6-8穩(wěn)定，pH<5,>9迅速滅活，器材可用1－3％鹽酸浸泡消毒；（二）化學(xué)因素影響1、脂溶劑乙醚、氯仿、去氧膽酸鹽使病毒滅活，均對病毒包膜具破壞性；2、醛類甲醛對核酸和蛋白均具破壞性，與氨基酸反應(yīng)，但對免疫原性無影響；3、氧化劑、鹵素病毒對H2O2、漂白粉、高錳酸鉀、碘及其鹵素化合物均敏感，70％乙醇多數(shù)滅活，次氯酸鹽、過氧乙酸對HBV有效4、抗生素抗生素無效，但可抑制細菌，分離病毒，大青葉、百蘭根、貫仲大黃抑制病毒四、病毒的繁殖

以噬菌體為例，了解病毒的繁殖：噬菌體的繁殖中，病毒粒子并無個體的生長過程，而只有其兩種基本成分的合成和裝配。

核酸復(fù)制+蛋白質(zhì)合成------裝配為病毒粒子。噬菌體的繁殖一般分為五個階段，即吸附--侵入--增殖（復(fù)制與生物合成）--成熟（裝配）--裂解（釋放）。在短時間內(nèi)能連續(xù)完成這五個階段而實現(xiàn)其繁殖的噬菌體，稱為烈性噬菌體，反之稱為溫和噬菌體。裂解性周期和增值性周期（一）、噬菌體繁殖（bacteriophage,phage）原核生物的病毒稱為噬菌體，真核生物的病毒為噬真菌體，1987年電鏡觀察過2850種噬菌體，其中2700種有尾。包括蝌蚪狀（dsDNA）、球狀（ssDNA、ssRNA）、絲狀（ssDNA）。1、Phage繁殖特點無個體生長，無年齡大小之別吸附---侵入---增殖（復(fù)制+合成）---裝配----釋放（20～60min）完成5個階段，宿主細胞裂解，為烈性噬菌體（virulentphage），裂解性周期；溫和噬菌體（temperatephage）：phage侵入宿主細胞，DNA隨宿主細胞DNA復(fù)制而復(fù)制，但phage的蛋白質(zhì)不能合成，宿主細胞不裂解，繼續(xù)分裂繁殖；2.噬菌體的繁殖過程

（1）、吸附（adsorption）過程：隨即碰撞和電荷吸引－非特異；尾絲尖端和宿主受體接觸頸須散開尾絲，附著于受體；phage把刺突、基板固定于細胞表面；尾絲尖端與受體發(fā)生共價結(jié)合，時間很短；宿主表面有多個吸附位點，約300個；不同噬菌體吸附的位點不同，如脂多糖、脂蛋白、磷壁酸、鞭毛等，T3、T4和T7噬菌體的受點是脂多糖層；T2和T6是脂蛋白質(zhì)影響因素：phage數(shù)量，陽離子濃度，溫度，輔助因子（色氨酸、生物素）感染復(fù)數(shù)，是感染時噬菌體與細菌的數(shù)量比值，也就是平均每個細菌感染噬菌體的數(shù)量m.o.i一般可達到250-360，超大m.o.i可引起自外裂解。（2）侵入（penetration）

T4噬菌體從吸附到侵入只需15秒，吸附引起構(gòu)象變化，將核酸注入宿主細胞內(nèi)，而蛋白質(zhì)外殼留在細胞外，溶菌酶水解壁肽聚糖，核酸通過微管孔注入；如果兩種以上病毒侵入，只增殖一種。病毒的侵入吸附與侵入

（3）生物合成（增殖，replication）核酸復(fù)制，蛋白生物合成，檢測不到病毒體，稱隱蔽期；脊V.3h，腺V.16h；增殖過程中基因表達特點基因表達有先有后基因表達的順序為:早期表達;次早期表達;核酸復(fù)制;晚期表達前一次表達產(chǎn)物是后一次表達的mRNA聚合酶晚期表達的結(jié)果是合成了各種裝配蛋白(另外還有溶菌酶)microbiologydsDNA噬菌體的轉(zhuǎn)錄、翻譯、復(fù)制增殖過程早期轉(zhuǎn)錄：先利用寄主的RNA多聚酶（細菌RNA聚合酶）轉(zhuǎn)錄噬菌體的mRNA，合成一系列新的早期蛋白質(zhì)（次早期mRNA聚合酶，更改蛋白等）。次早期轉(zhuǎn)錄：更改后的RNA多聚酶轉(zhuǎn)錄次早期的mRNA，合成次早期的蛋白質(zhì)——DNA酶、DNA聚合酶、5-羥甲基胞嘧啶合成酶和晚期的mRNA多聚酶

在DNA聚合酶的作用下進行噬菌體核酸的復(fù)制晚期轉(zhuǎn)錄：轉(zhuǎn)錄晚期的后期mRNA，合成晚期的蛋白質(zhì)。在T類噬菌體中，合成的后期蛋白質(zhì)是噬菌體頭和尾成分的亞單位，還有噬菌體的溶菌酶。

然后開始噬菌體核酸的復(fù)制。在含有雙股DNA的噬菌體中，復(fù)制過程與一般DNA復(fù)制相似。T4DNA復(fù)制的特點：一是由于T4

DNA中的胞嘧啶被羥甲基胞嘧啶取代，所以在其DNA復(fù)制之前，必須由噬菌體編碼的酶合成羥甲基胞嘧啶，并且在T4

DNA合成后，羥甲基胞嘧啶被葡萄糖基化，以保護T4

DNA免遭E.coli核酸酶破壞。二是在T4

DNA復(fù)制過程中，由6—8個拷貝結(jié)合形成非常長的DNA鏈。(多連體)（4）裝配

各個部件自行裝配：DNA縮合；衣殼包裹DNA形成完整頭部；尾部獨立裝配；頭尾結(jié)合；T4噬菌體需要30種蛋白參與（5）裂解、釋放脂肪酶和溶菌酶作用下，細胞裂解，子代phage釋放；水解細胞膜、細胞壁-------裂解-----釋放子代噬菌體大腸桿菌T系列15---25min裂解量：平均每一宿主細胞裂解后產(chǎn)生的子代噬菌體數(shù)，T2為150個，T4為100個；自外裂解（lysisfromwithout)：大量phage吸附在同一宿主細胞表面，釋放大量溶菌酶，導(dǎo)致細胞裂解；3、噬菌體的效價測定（噬菌體個數(shù)/ml）

在菌苔上逐步形成的噬菌體群體，由于其侵蝕宿主細胞的結(jié)果會使菌苔上出現(xiàn)一個個噬菌斑。因每種噬菌體的噬菌斑有一定的形狀

0.10.2噬菌體稀釋液敏感宿主菌液雙層平板檢測噬菌斑底層平板2％上層平板1％噬菌體+宿主雙層平板法：底層瓊脂，上層瓊脂<45度,細菌與phage混合，37度10h；優(yōu)點：彌補不平；同一平面，大噬菌斑；上層瓊脂較稀，形成的噬菌斑較大、特征較明顯每種phage的噬菌斑形態(tài)固定－鑒定依據(jù)，大小2mm，約含107－109phage效價（titre，titer）：每ml試樣中含的具侵染性的phage粒子數(shù)，又稱噬菌斑形成單位數(shù)（plaque－formingunit，pfu），感染中心數(shù)（infectivecentre);成斑率噬菌斑效價/電鏡效價4、噬菌體的一步生長曲線少量病毒與敏感細胞接觸，病毒吸附后，高倍稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)，定時取樣測定培養(yǎng)物中的病毒效價，以感染時間為橫坐標，病毒效價為縱坐標，繪制出病毒特征性的繁殖曲線，即一步生長曲線；潛伏期（隱晦期、胞內(nèi)累計期）裂解期、平穩(wěn)期一步生長曲線定量描述烈性噬菌體生長規(guī)律的實驗曲線，稱作一步生長曲線或一級生長曲線。她可反映噬菌體的三個最重要的特性參數(shù)---潛伏期、裂解期、和裂解量。分三個時期，反映三個重要參數(shù)——潛伏期、裂解期、平穩(wěn)期、裂解量潛伏期從噬菌體吸附細菌細胞至細菌細胞釋放出新的噬菌體的最短時間。分隱晦期、胞內(nèi)累積期（潛伏后期）。潛隱期（隱晦期）：從噬菌體吸附細菌細胞到細胞內(nèi)重新出現(xiàn)噬菌體的顆粒的最短時間。裂解期從被感染的第一個細胞裂解至最后一個細胞裂解完畢所經(jīng)歷的時間。平穩(wěn)期指感染后的宿主細胞已全部裂解，溶液中噬菌體效價達到最高點的時期。裂解量每種噬菌體侵入敏感細胞，平均每個細胞最后能裝配完成和釋放出的噬菌體數(shù)稱為裂解量，它是相對固定的。裂解量的計算公式裂解量=a/ba:裂解期末平均噬菌斑數(shù)b:潛伏期平均噬菌斑數(shù)5、溶源性(lusogeny)(1)溫和噬菌體和溶源菌當噬菌體DNA進入細胞后，在宿主與病毒的相互作用下，病毒DNA整合到宿主的DNA上，同宿主DNA同步復(fù)制，這種噬菌體為溫和性噬菌體。溫和噬菌體的侵入并不引起宿主細胞裂解，稱溶原性；宿主為溶原菌，它可與溫和噬菌體長期共存，一般不出現(xiàn)有害影響；(2)整合的DNA為前噬菌體，或原噬菌體，原噬菌體一旦脫離宿主DNA就開始復(fù)制，引起宿主裂解。含有原噬菌體的宿主細胞稱為溶源菌，溶源菌所特有的性質(zhì)為溶源性。(3)溶源性表現(xiàn)如下：

產(chǎn)生烈性噬菌體的潛在能力具有同源噬菌體感染的免疫性（CI抑制蛋白產(chǎn)生）溶源菌在外界理化因子誘導(dǎo)下，可發(fā)生高頻率的裂解宿主細胞有時能產(chǎn)生新的生理特性，如溶源性白喉桿菌產(chǎn)生白喉毒素（生物導(dǎo)彈(定向藥物)中常用來作為殺傷腫瘤細胞的因子）(4)溫和性噬菌體的三種狀態(tài)：游離態(tài)

整合態(tài)----原噬菌體態(tài)營養(yǎng)態(tài)----營養(yǎng)期噬菌體（理化誘導(dǎo)，積極復(fù)制，合成和裝配狀態(tài)）(5)常見的溫和性噬菌體大腸桿菌λ噬菌體大腸桿菌Mu-1噬菌體大腸桿菌P1、P2噬菌體其中大腸桿菌λ噬菌體研究最清楚，E.coliK12（λ）表示cos位點------12個堿基對構(gòu)成的粘性末端(6)、溶源菌的檢測（自發(fā)或誘導(dǎo)）

少量溶源菌與大量指示菌（遇溶源菌裂解后釋放的溫和噬菌體會發(fā)生裂解循環(huán)）混合，加瓊脂培養(yǎng)基倒平板，培養(yǎng)后顯示出特殊噬菌斑。溶源菌少數(shù)個體自發(fā)裂解，形成中央有溶源菌的小菌落，四周有透明圈。溶原性細菌具免疫性：溶原性細菌對其本身產(chǎn)生的phage或外來的同源phage不敏感，可進入細菌，但不能增殖，也不裂解；指示菌菌苔溶源菌菌落透明的裂解圈溶源菌獨特噬菌斑二、植物病毒的繁殖

植物病毒大部分屬于ssRNA病毒，其基