第8章基因工程原理PrinciplesofGeneEngineering本章內(nèi)容1基因工程的歷史和發(fā)展2基因工程的基本內(nèi)容和技術(shù)3基因工程相關(guān)酶學(xué)4基因工程中的載體和宿主系統(tǒng)5目的基因的獲得和分離方法6外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞7重組體的鑒定和分析8外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)9外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)10蛋白質(zhì)工程11基因工程的應(yīng)用和展望PrinciplesofGeneEngineering將外源基因在特定的宿主細(xì)胞中表達(dá)，獲得基因的產(chǎn)物——蛋白質(zhì)，這才是基因工程的目的所在目前用于外源基因表達(dá)的宿主細(xì)胞有原核的，也有真核的；有植物細(xì)胞也有動(dòng)物細(xì)胞；也有利用整個(gè)生物體作為外源基因表達(dá)的宿主的；他們各有特點(diǎn)，分別在不同的情況下使用。8外源基因的表達(dá)PrinciplesofGeneEngineering與外源基因表達(dá)有關(guān)的幾個(gè)重要概念啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)終止信號(hào)融合蛋白與非融合蛋白包涵體PrinciplesofGeneEngineering選用強(qiáng)的啟動(dòng)子可以使基因處于高水平表達(dá)。原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因常用的強(qiáng)啟動(dòng)子有（1）lacUV5，即乳糖操縱子的啟動(dòng)子，但是經(jīng)過(guò)了改造，活性無(wú)須cAMP活化，被阻遏蛋白laci關(guān)閉，可以被IPTG誘導(dǎo)。（2）tac啟動(dòng)子，由trp啟動(dòng)子的-35區(qū)和lac啟動(dòng)子的-10區(qū)融合而成，可被IPTG誘導(dǎo)。基因表達(dá)控制元件1---啟動(dòng)子PrinciplesofGeneEngineering（3）λPL或PR啟動(dòng)子受λ阻遏蛋白調(diào)節(jié)，溫度敏感型突變體（λCIts857）在30℃時(shí)啟動(dòng)子處于阻遏狀態(tài)，在超過(guò)40℃時(shí)阻遏蛋白失活，基因得到表達(dá)。（4）ompF是低滲透壓外膜蛋白基因的啟動(dòng)子，其溫度敏感突變體在低溫時(shí)無(wú)活性，溫度升高有活性；（5）噬菌體T7的啟動(dòng)子，可以被T7RNA聚合酶高效特異識(shí)別并、高效轉(zhuǎn)錄，常用于構(gòu)建高效表達(dá)系統(tǒng)或體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。PrinciplesofGeneEngineering基因表達(dá)控制元件2----核糖體結(jié)合位點(diǎn)大腸桿菌的核糖體結(jié)合位點(diǎn)是一段長(zhǎng)3-9個(gè)核苷酸，富含嘌呤的序列，位于起始密碼子上游3-11個(gè)核苷酸處。稱(chēng)為SD序列。mRNA的翻譯效率受SD序列與16SrRNA3’端互補(bǔ)程度的影響，還受到SD序列與起始密碼子之間的距離以及起始密碼子上下游序列的影響。PrinciplesofGeneEngineering基因表達(dá)控制元件3---終止信號(hào)在UAAUAGUGA三個(gè)終止信號(hào)中，UAA的終止信號(hào)作用最強(qiáng)。PrinciplesofGeneEngineering外源基因的表達(dá)---融合蛋白質(zhì)和非融合蛋白質(zhì)外源基因直接在宿主細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)物就是非融合蛋白質(zhì)。但是有時(shí)候因?yàn)槟撤N原因，外源基因不能直接在宿主細(xì)胞中表達(dá)，需要在外源基因的5’端（或3‘端）接上一段宿主細(xì)胞或其他來(lái)源的基因片段才能在細(xì)胞中表達(dá)，這樣表達(dá)出來(lái)的蛋白質(zhì)的多肽鏈就是一個(gè)融合蛋白質(zhì)。PrinciplesofGeneEngineering融合蛋白質(zhì)由兩個(gè)部分組成，N端的序列是目的基因之外的其他基因的產(chǎn)物，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物位于C端。融合蛋白質(zhì)分離后，利用特殊的試劑（如溴化氰）或特異的蛋白質(zhì)水解酶（如胰蛋白酶）將兩個(gè)部分分開(kāi)，除去N端部分的序列，就可以得到目的基因的產(chǎn)物。PrinciplesofGeneEngineering（1）外源基因的活性形式中第一個(gè)氨基酸可能不是蛋氨酸，基因表達(dá)時(shí)需要在基因前面加入起始密碼子，但是這種融合蛋白質(zhì)可能會(huì)影響到其活性。（2）外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)量較低，融合蛋白質(zhì)可以增加外源基因產(chǎn)物的表達(dá)量。（3）外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定，易于被宿主的蛋白酶降解，融合的蛋白可以增加其穩(wěn)定性。（4）融合蛋白質(zhì)不影響某些抗體表位，可以容易進(jìn)行抗體工程。（5）與某些特異的多肽或蛋白質(zhì)融和，易于在分離后迅速純化和檢測(cè)。外源基因不能直接在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的情況：PrinciplesofGeneEngineering分泌蛋白原核生物和真核生物的分泌蛋白質(zhì)的N端都有一段信號(hào)肽，可以引導(dǎo)新合成的多肽鏈穿過(guò)細(xì)胞膜，信號(hào)肽酶將信號(hào)肽切除。利用這種機(jī)制，將欲表達(dá)的蛋白的基因與信號(hào)肽基因序列融合形成融合蛋白，蛋白表達(dá)出來(lái)后就被分泌到細(xì)胞外或培養(yǎng)基中。對(duì)于蛋白質(zhì)的分離是非常方便的。PrinciplesofGeneEngineering包涵體可以將細(xì)胞破壁和離心而收集，再經(jīng)過(guò)溶解和復(fù)性有可能得到有活性的蛋白。不同蛋白的復(fù)性條件不同。包涵體由于基因表達(dá)部位低電勢(shì)以及外源蛋白分子特殊結(jié)構(gòu),低電荷,無(wú)糖基化等,使得外源蛋白與周?chē)碾s蛋白或核酸等形成不溶解的聚合物,叫做包涵體。包涵體的形成與許多因素有關(guān)。包涵體中的蛋白是沒(méi)有生物活性的,在一定條件下,有些包涵體中的蛋白可以被“復(fù)性”,重新具有正常的蛋白活性.不同包涵體中蛋白的復(fù)性條件不同。PrinciplesofGeneEngineering大腸桿菌生長(zhǎng)迅速，容易繁殖，已經(jīng)成為應(yīng)用最為廣泛的基因表達(dá)宿主細(xì)胞。雖然真核基因在大腸桿菌中表達(dá)會(huì)遇到許多困難，但是經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，大腸桿菌中表達(dá)真核基因的數(shù)目還在增加，許多以前遇到的困難已經(jīng)得到較好的解決。外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的策略PrinciplesofGeneEngineering在大腸桿菌中外源基因高效表達(dá)的策略（1）表達(dá)載體的優(yōu)化表達(dá)載體除了具有一般表達(dá)載體的基本元件外，還應(yīng)該注意他們之間的優(yōu)化。如啟動(dòng)子的有效性與高效性，終止密碼子的有效性，SD序列與起始密碼子之間的距離等，另外使用高拷貝質(zhì)粒有利于外源基因的高表達(dá)。基因工程中外源基因的高效表達(dá)是許多因素綜合作用的結(jié)果。PrinciplesofGeneEngineering（2）影響基因的轉(zhuǎn)錄的因素a啟動(dòng)子的強(qiáng)弱是控制外源基因表達(dá)效率的關(guān)鍵因素之一b基因的阻遏子載體中的阻遏基因應(yīng)該是能夠調(diào)控的，這樣可以選擇基因表達(dá)的最佳時(shí)機(jī)c原核增強(qiáng)子樣序列可以增強(qiáng)啟動(dòng)子的基因轉(zhuǎn)錄效率d轉(zhuǎn)錄終止子PrinciplesofGeneEngineering（3）影響翻譯水平的因素近來(lái)發(fā)現(xiàn)，基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控是影響水平的更重要的因素。a基因與核糖體的結(jié)合部位的調(diào)控——基因的SD序列、SD序列與起始密碼子之間的距離以及密碼子的偏愛(ài)性b基因翻譯起始區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)翻譯起始的影響——提高翻譯的起始效率和mRNA的穩(wěn)定性PrinciplesofGeneEngineering（4）影響蛋白質(zhì)水平的因素防止蛋白質(zhì)翻譯出來(lái)之后被降解以及將蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外等。（5）其他因素如菌種、培養(yǎng)基條件、細(xì)菌的生長(zhǎng)條件等。PrinciplesofGeneEngineering真核基因在大腸桿菌中表達(dá)可能會(huì)遇到的一些困難a原核細(xì)胞的RNA轉(zhuǎn)錄酶不能識(shí)別真核細(xì)胞的啟動(dòng)子b真核細(xì)胞的基因前面沒(méi)有SD序列。c真核基因含有內(nèi)含子，原核細(xì)胞沒(méi)有d原核細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有真核細(xì)胞的蛋白翻譯后的修飾體系，如二硫鍵的形成，糖基化，磷酸化等。e真核蛋白會(huì)被原核細(xì)胞作為外源蛋白而降解f真核蛋白前面有信號(hào)肽，原核細(xì)胞內(nèi)不能正確切除，導(dǎo)致不能形成正確的蛋白結(jié)構(gòu)，形成沒(méi)有生物學(xué)活性的蛋白包含體結(jié)構(gòu)。PrinciplesofGeneEngineering9外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)為了便于操作，一般在真核細(xì)胞中表達(dá)使用的表達(dá)載體都具有在原核細(xì)胞中生長(zhǎng)的復(fù)制起點(diǎn)，因此，均屬于穿梭質(zhì)粒。PrinciplesofGeneEngineering酵母細(xì)胞是研究最為清楚的真核細(xì)胞，有“真核細(xì)胞中的大腸桿菌”之稱(chēng)。1996年基因組序列測(cè)定完畢。在真核生物的基因工程中是首選的宿主細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)a是單細(xì)胞生物，操作簡(jiǎn)單，易于生長(zhǎng)。b具有真核細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的加工翻譯體系，表達(dá)產(chǎn)物與天然蛋白類(lèi)似（1）在酵母細(xì)胞中的表達(dá)PrinciplesofGeneEngineering用于酵母中生長(zhǎng)的基因克隆載體常用的有五類(lèi)：整合質(zhì)粒（YIP），附加體質(zhì)粒（YEP），復(fù)制質(zhì)粒（YRP），有著絲粒的質(zhì)粒（YCP），酵母人工染色體（YAC）。常用的宿主有：常規(guī)表達(dá)酵母：釀酒酵母、栗酒裂殖酵母非常規(guī)表達(dá)酵母：巴斯德畢赤酵母、漢遜多型酵母PrinciplesofGeneEngineering目前應(yīng)用釀酒酵母表達(dá)體系表達(dá)了許多外源基因，如乙型肝炎疫苗、人胰島素、人粒細(xì)胞集落刺激因子等。但是釀酒酵母在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生乙醇，對(duì)蛋白質(zhì)會(huì)過(guò)度糖基化，合成的蛋白質(zhì)的分泌能力有限等。酵母表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用PrinciplesofGeneEngineering巴斯德畢赤酵母是一種甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母。甲醇可以誘導(dǎo)細(xì)胞中與甲醇代謝有關(guān)的酶的高效表達(dá)。其中一種酶叫做乙醇氧化酶，啟動(dòng)子AOX1是一種可誘導(dǎo)的強(qiáng)啟動(dòng)子。利用它可以高水平表達(dá)外源基因。這種酵母的分泌能力比釀酒酵母強(qiáng)，但是這種酵母的遺傳背景了解的還不清楚，遺傳改造難度較大。目前已經(jīng)有幾十種外源基因獲得表達(dá)，如乙型肝炎表面抗原、人腫瘤壞死因子、人表皮生長(zhǎng)因子和鏈激酶等。PrinciplesofGeneEngineering根癌土壤農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）可以誘發(fā)裸子植物和雙葉植物產(chǎn)生根瘤的細(xì)菌。其中分離到的Ti質(zhì)粒，具有誘發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤的作用。將外源基因插入到質(zhì)粒的特定的區(qū)域，再轉(zhuǎn)化植物即可將外源基因轉(zhuǎn)化到植物的染色體上，從而獲得轉(zhuǎn)基因植物。但是Ti質(zhì)粒太大，有兩種解決辦法：利用共整和載體或構(gòu)建二元載體系統(tǒng)。另外用于植物轉(zhuǎn)化的載體來(lái)自經(jīng)過(guò)改造的發(fā)根土壤農(nóng)桿菌的產(chǎn)生根毛的質(zhì)粒Ri以及各種植物病毒（花椰菜花葉病毒）等。（2）外源基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)PrinciplesofGeneEngineering在哺乳動(dòng)物中使用的表達(dá)載體一般都是由動(dòng)物病毒載體改造而成，如SV40、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒等。載體中的元件包括：原核生物的復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、真核生物的表達(dá)控制元件、真核細(xì)胞中的復(fù)制和選擇的遺傳因子等。（3）外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)PrinciplesofGeneEngineering目前逆轉(zhuǎn)錄病毒因?yàn)楦咝Ц腥竞驼隙妒荜P(guān)注，發(fā)展成為基因工程中的重要載體。但只能感染正在分裂的細(xì)胞，腺病毒可以容納更大的外源基因，并且可以感染非分裂的細(xì)胞；痘病毒可以用于構(gòu)建工程疫苗。各種病毒載體各有其特點(diǎn)和特殊用途。PrinciplesofGeneEngineering10蛋白質(zhì)工程（proteinengineering）在基因工程中人們發(fā)現(xiàn)，生物體的許多天然蛋白質(zhì)對(duì)于人們的產(chǎn)業(yè)化等開(kāi)發(fā)不合適，必需對(duì)他們進(jìn)行改造。美國(guó)基因公司的Ulmer在1983年首次提出蛋白質(zhì)工程這個(gè)概念，自此之后，蛋白質(zhì)工程迅速發(fā)展，已經(jīng)成為生物工程的重要組成部分。PrinciplesofGeneEngineering蛋白質(zhì)工程是指通過(guò)蛋白質(zhì)化學(xué)、蛋白質(zhì)晶體學(xué)和動(dòng)力學(xué)的研究獲取有關(guān)蛋白質(zhì)的物理化學(xué)各方面的信息，在此基礎(chǔ)上對(duì)編碼該蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行有目的的改造，并通過(guò)基因工程等手段對(duì)其進(jìn)行表達(dá)和分離純化，最終投入應(yīng)用。PrinciplesofGeneEngineering蛋白質(zhì)工程的發(fā)展是許多學(xué)科相互融合、共同努力的結(jié)果。如生物物理學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和化學(xué)工程學(xué)等。蛋白質(zhì)工程首先必需積累成千上萬(wàn)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)，找出蛋白質(zhì)分子之間的進(jìn)化關(guān)系、一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系、結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系等規(guī)律。尤其是計(jì)算機(jī)科學(xué)和圖象顯示技術(shù)的的發(fā)展，已經(jīng)使得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析、三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和模型建立，分子設(shè)計(jì)和能量計(jì)算等理論和技術(shù)以及相關(guān)軟件，正在發(fā)展成為生物信息學(xué)的一門(mén)分支。在蛋白質(zhì)工程的定向改造的分子設(shè)計(jì)中是不可缺少的。10.1蛋白質(zhì)分子的設(shè)計(jì)和改造PrinciplesofGeneEngineering采用分子生物學(xué)的方法，也可以推測(cè)出一些未知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，采用定位誘變技術(shù)對(duì)基因改造的結(jié)果可以為分子改造提供新的設(shè)計(jì)方案。蛋白質(zhì)工程實(shí)際上是對(duì)生物進(jìn)化的模擬，按照蛋白質(zhì)形成的規(guī)律，改造蛋白質(zhì)或構(gòu)建新的蛋白質(zhì)。PrinciplesofGeneEngineering蛋白質(zhì)工程可以說(shuō)是新一代的基因工程。一般首先經(jīng)過(guò)周密的分子設(shè)計(jì)，然后依靠基因工程獲得突變型的蛋白質(zhì)（mutein），以檢驗(yàn)是否達(dá)到了預(yù)期的效果，如果改造的結(jié)果不理想，還需要重新設(shè)計(jì)再次改造，往往要經(jīng)過(guò)多次實(shí)踐摸索才能達(dá)到改進(jìn)蛋白質(zhì)性能的預(yù)定目標(biāo)。PrinciplesofGeneEngineering10.2蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)化蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)改造在技術(shù)上取得重大突破后，備受各界關(guān)注，十多年來(lái)發(fā)展極為迅速，取得了一系列重要成果。然而，這些成果多數(shù)屬子理論上的，或是技術(shù)上的，獲得改進(jìn)性能的實(shí)用蛋白質(zhì)并不多。其主要原因在于分子設(shè)計(jì)的不精確性。PrinciplesofGeneEngineering分子設(shè)計(jì)的主要依據(jù)來(lái)自三個(gè)方面關(guān)系的知識(shí)：①蛋白質(zhì)分子間的進(jìn)化關(guān)系，從同源蛋白質(zhì)序列的微觀(guān)差異可找出其對(duì)空間結(jié)構(gòu)和生物功能的影響：另一方面蛋白質(zhì)的進(jìn)化研究也為蛋白質(zhì)的構(gòu)造規(guī)則提供了信息。②蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)的關(guān)系，由此可以從一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)。③蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，找出結(jié)構(gòu)改變對(duì)功能的影響。PrinciplesofGeneEngineering從已知蛋白質(zhì)的上述關(guān)系可用以推測(cè)一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變對(duì)空間結(jié)構(gòu)和生物功能可能的影響，而目前對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)規(guī)律的認(rèn)識(shí)還十分有限，這種推測(cè)也就并不可靠，往往差之毫厘，失之千里。于是蛋白質(zhì)改造的另一途徑即在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬生物分子的進(jìn)化，通過(guò)隨機(jī)變異和靶功能的選擇，多次重復(fù)，從而獲得改進(jìn)性能的蛋白質(zhì)。此過(guò)程稱(chēng)為實(shí)驗(yàn)進(jìn)化。PrinciplesofGeneEngineering蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化基本過(guò)程正常基因變異的基因淘汰有害突變，保留有益突變篩選引入突變使用無(wú)校對(duì)功能的DNA聚合酶DNA改組---DNA隨機(jī)片段化，自身引發(fā)PCR，重組合PCR噬菌體表面展示技術(shù)親和選擇等PrinciplesofGeneEngineering10.3蛋白質(zhì)工程的進(jìn)展目前蛋白質(zhì)工程更多側(cè)重于對(duì)蛋白質(zhì)的理論研究，并已成為常用的不可或缺的方法。對(duì)于蛋白質(zhì)的研究，大致有以下幾個(gè)方面：①有助于對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析，揭示蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的規(guī)律，由一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)空間結(jié)構(gòu)。②確定蛋白質(zhì)分子問(wèn)的相互關(guān)系，找出相互作用的氨基酸殘基。③闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系．了解蛋白質(zhì)的活性部位一和一級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)生物功能的影響。PrinciplesofGeneEngineering在應(yīng)用方面，幾乎所有類(lèi)型具有開(kāi)發(fā)前景的蛋白質(zhì)和多肽都用蛋白質(zhì)工程作過(guò)改造的嘗試，并取得不同程度的成果。研究最多、取得成果最顯著的是生物技術(shù)藥物和工業(yè)用酶的蛋白質(zhì)工程。蛋白質(zhì)和多肽類(lèi)藥物包括激素、細(xì)胞因子、酶、酶的激活劑和抑制劑、受體和配體、細(xì)胞毒素和殺菌肽以及抗體等。作為藥物，希望通過(guò)改造以提高其活性、特異性和穩(wěn)定性，控制分子聚集，降低免疫原性和毒副反應(yīng)．延長(zhǎng)在體內(nèi)的半衰期，增強(qiáng)對(duì)靶位點(diǎn)的導(dǎo)向性等。PrinciplesofGeneEngineering水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特異抑制劑，它有多種變異體，由65或66個(gè)氨基酸殘基組成。水蛭素在臨床上可作為抗栓藥物用于治療血栓疾病。為提高水蛭素活性，在綜合各變異體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的基礎(chǔ)上提出改造水蛭素主要變異體HV2的設(shè)計(jì)方案，將47位的Asn變成Lys，使其與分子內(nèi)Thr4或Asp5間形成氫鍵來(lái)幫助水蛭索N端肽段正確取向，從而提高抗凝血效率，試管試驗(yàn)提高達(dá)4倍．在動(dòng)物模型上檢驗(yàn)抗血栓形成的效果，提高20倍。PrinciplesofGeneEngineering生長(zhǎng)激素通過(guò)對(duì)它特異受體的作用促進(jìn)細(xì)胞和機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育，然而它不僅可以結(jié)合生長(zhǎng)激素受體，還可以結(jié)合許多種不同類(lèi)型細(xì)胞的催乳激素受體，引起其他生理過(guò)程。在治療過(guò)程中為減少副作用，需使人的重組生長(zhǎng)激素(rh-GH)只與生長(zhǎng)激素受體結(jié)合．盡可能減少與其他激素受體的結(jié)合。PrinciplesofGeneEngineering經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，二者受體結(jié)合區(qū)有一部分重疊，但并不完全相同，有可能通過(guò)改造加以區(qū)別。由于人的生長(zhǎng)激素和催乳激素受體結(jié)合需要鋅離子參與作用．而它與生長(zhǎng)激素受體結(jié)合則無(wú)需鋅離子，于是考慮取代充當(dāng)鋅離子配基的氨基酸側(cè)鏈，如第18和21位的His和第174位的Glu。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)先設(shè)想一致，但要開(kāi)發(fā)作為臨床用藥物還有大量研究工作要做。PrinciplesofGeneEngineering組織型纖溶酶原激活刑(t-PA)和單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑(scU-PA)是兩種具有血纖維蛋白專(zhuān)一性的溶栓劑，可在血栓(血纖維蛋白)表面激活纖溶酶原，有效溶解血栓。但在臨床治療中大劑量使用的情況下二者的專(zhuān)一性均有限，仍可引起全身性纖溶酶原的激活而造成出血傾向。與u-PA相比，t-PA與纖溶酶原的親和力較低．而與血纖維蛋白的親和力較高；當(dāng)血纖維蛋白與纖溶酶原結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)與t-PA的親和力就大為提高。PrinciplesofGeneEngineering于是設(shè)想構(gòu)建嵌合型溶栓劑，期望綜合二者之長(zhǎng)．即將t-PA的識(shí)別控制序列(1-263)與u-PA激活纖溶溶酶的蛋白酶序列(144-408)融合在一起，并刪除內(nèi)源性抑制劑作用位點(diǎn)的4個(gè)氨基酸殘基(178—181)。PrinciplesofGeneEngineering所得嵌合tu-PA同時(shí)獲得了親本t-PA的反應(yīng)專(zhuān)一性和對(duì)血纖維蛋白的親和性以及親本u-PA的激活性質(zhì)，并消除了內(nèi)源抑制劑的抑制作用，體外溶栓能力較強(qiáng)，而血纖維蛋白原消耗較小。如果用識(shí)別血纖維蛋白或血小板表面糖蛋白的單鏈抗體與u-PA活性區(qū)融合，其嵌合分子對(duì)血栓的導(dǎo)向功能更強(qiáng)。PrinciplesofGeneEngineering已經(jīng)分離并進(jìn)行生物化學(xué)研究的酶不下幾千種，但是再工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用的酶只有幾十種，可見(jiàn)工業(yè)用酶的開(kāi)發(fā)潛力還很大。使用蛋白質(zhì)工程的方法來(lái)提高酶的活性、特異性和穩(wěn)定性，改變反應(yīng)介質(zhì)和動(dòng)力學(xué)的性質(zhì)，從而改進(jìn)現(xiàn)有的工業(yè)用酶，開(kāi)發(fā)更多的新的工業(yè)用酶。例如在去污劑種需要添加蛋白酶和脂酶，但是天然分離得到的酶一般達(dá)不到需要的耐熱、耐堿、耐氧化劑等的性能，需要加以改造。PrinciplesofGeneEngineering11基因工程的應(yīng)用和展望11.1基因工程開(kāi)辟了生物學(xué)研究的新紀(jì)元基因工程的新技術(shù)核新方法為解決生物化學(xué)、分子生物學(xué)核醫(yī)學(xué)中的一些重大問(wèn)題提供了強(qiáng)有力的手段。DNA序列的測(cè)定蛋白質(zhì)序列的推測(cè)可以代替煩瑣的蛋白質(zhì)序列測(cè)定細(xì)胞內(nèi)微量蛋白質(zhì)的大量獲得不再困難基因功能的研究，反向遺傳學(xué)，反向生物學(xué)生物體全基因組序列的測(cè)定新的生物學(xué)領(lǐng)域的出現(xiàn)：結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)，神經(jīng)分子生物學(xué)，發(fā)育分子生物學(xué)是目前發(fā)展最快的學(xué)科。PrinciplesofGeneEngineering基因組時(shí)代與后基因組時(shí)代蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)（1994年）XX組與XX組學(xué)不斷出現(xiàn)的時(shí)代Gene--Genome—genomicsProtein---proteome--proteomicsRNA--RNomicsTranscription--transcriptomicsPrinciplesofGeneEngineering11.2基因工程促進(jìn)了生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的興起基因工程首先在醫(yī)藥核化工領(lǐng)域嶄露頭角，其實(shí)最大的用武之地是農(nóng)業(yè)和醫(yī)療保健領(lǐng)域。（1）基因工程藥物1977年Itakura和BoyerH利用當(dāng)時(shí)剛趨成熟的基因工程技術(shù)，在大腸桿菌中產(chǎn)生下丘腦激素14肽生長(zhǎng)素釋放抑制激素，商品名Somatostatin(SMT)。該激素可用于治療兒童發(fā)育時(shí)期因生長(zhǎng)素分泌過(guò)多造成的四肢巨大癥。從1L工程菌發(fā)酵液中可得到50mg的基因表達(dá)產(chǎn)物，相當(dāng)于50萬(wàn)頭羊下丘腦提取的該激素量，由此可以了解到基因工程產(chǎn)業(yè)化的意義。PrinciplesofGeneEngineering其后，基因工程藥物不斷成功問(wèn)世。1978年胰島素原在大腸桿茵中表達(dá)成功。1979年人生長(zhǎng)素基因在大腸桿菌中獲得直接表達(dá)。1980年人白細(xì)胞干擾素基因獲得克隆和表達(dá)。1981年抗口蹄疫的基因工程抗原研制成功。1982年乙肝抗原在酵母菌中表達(dá)成功。同年轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也分別獲得成功。PrinciplesofGeneEngineering基因工程藥物包括各類(lèi)激素、酶、酶的激活劑抑制劑、受體和配體、細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)肽、抗原和抗體等。細(xì)胞內(nèi)微量的細(xì)胞因子由于采用基因工程手段大量制備，才有可能研究其生物學(xué)功能和臨床應(yīng)用價(jià)值。使用蛋白質(zhì)工程設(shè)計(jì)出自然界不存在的新型蛋白質(zhì)和多肽，意義更為重大。PrinciplesofGeneEngineering利用基因工程生產(chǎn)的人類(lèi)蛋白質(zhì)藥物尿激酶腫瘤壞死因子松弛素神經(jīng)生長(zhǎng)因子組織性纖溶酶原激活劑血清清蛋白淋巴細(xì)胞毒素白細(xì)胞介素干擾素胰島素生長(zhǎng)激素凝血因子VIII凝血因子IX紅細(xì)胞生成素上皮生長(zhǎng)因子降鈣素促腎上腺皮質(zhì)激素B細(xì)胞生長(zhǎng)因子集落刺激因子絨毛膜促性腺激素生長(zhǎng)激素釋放因子巨噬細(xì)胞激活因子PrinciplesofGeneEngineering使用基因工程手段可以做到定向給藥（分子導(dǎo)向藥物）第三代抗體的出現(xiàn)——抗體工程，使得抗體的獲得不再需要免疫動(dòng)物。PrinciplesofGeneEngineering（2）基因工程在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用生物技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，出現(xiàn)第二次“綠色革命”。農(nóng)作物新品種的培育周期大大縮短農(nóng)作物各種抗逆性的提高農(nóng)作物的產(chǎn)量提高現(xiàn)代化的新型農(nóng)業(yè)（無(wú)土農(nóng)業(yè)）新型轉(zhuǎn)基因家畜的出現(xiàn)，新品種的出現(xiàn)植物生物反應(yīng)器PrinciplesofGeneEngineering（3）基因治療（genetherapy）就是向受體細(xì)胞內(nèi)引入具有正常功能的基因，以糾正或補(bǔ)償基因的缺陷，也可以利用引入的基因殺死體內(nèi)病原菌或惡性細(xì)胞。一些以前無(wú)有效治療手段的疾病，如遺傳病、腫瘤、心腦血管疾病、老年癡呆、愛(ài)滋病等，有希望通過(guò)基因治療來(lái)達(dá)到防治的目的。PrinciplesofGeneEngineering1990年，美國(guó)正式開(kāi)始首例臨床基因治療，患兒由于腺苷脫氨酶(ADA)基因缺陷，而患重度免疫缺陷癥(SCID)。研究人員將克隆的腺苷脫氨酶基因(ada)導(dǎo)入患者淋巴細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生腺苷脫氨酶，然后再將這種淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)入患者體內(nèi)，患者癥狀有明顯緩解，治療取得令人鼓舞的成功。美國(guó)之后，許多國(guó)家都開(kāi)始了基因治療試驗(yàn)。我國(guó)于1991年首例B型血友病基因治療也獲得滿(mǎn)意結(jié)果。PrinciplesofGeneEngineering然而目前基因治療在技術(shù)上還未成熟，許多試驗(yàn)都沒(méi)有成功。關(guān)鍵問(wèn)題是：①如何選擇有效的治療基因。②如何構(gòu)建安全載體，病毒載體效率較高，但卻有潛在的危險(xiǎn)性。③如何定向?qū)氚屑?xì)胞，并獲得高表達(dá)。人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成必特有助于人類(lèi)重要疾病基因的發(fā)現(xiàn)，基因治療技術(shù)也在不斷改進(jìn)。根據(jù)樂(lè)觀(guān)的估計(jì)，在今后20年中，基因治療有可能取得重大突破，成為臨床廣泛采用的有效治療手段PrinciplesofGeneEngineering11.3基因工程的展望20世紀(jì)70年代初基因工程的出現(xiàn)帶動(dòng)了生物技術(shù)的興起和發(fā)展，由此使生物科學(xué)進(jìn)人了一個(gè)新的發(fā)展時(shí)期，其主要特點(diǎn)是：第一，生物科學(xué)得以前所未有的高速度向前發(fā)展。技術(shù)上的不斷創(chuàng)新和突破，使得生物科學(xué)具有賴(lài)以迅猛發(fā)展的方法和手段。第二，生物科學(xué)與工程學(xué)相結(jié)合，出現(xiàn)空前規(guī)模大科學(xué)工程的研究。巨大的信息網(wǎng)將世界各實(shí)驗(yàn)室相連，生物科學(xué)的研究變得更有計(jì)劃、更有組織、更有規(guī)模了。PrinciplesofGeneEngineering第三，生物科學(xué)進(jìn)入了一個(gè)創(chuàng)造和實(shí)踐的新時(shí)代。如果說(shuō)過(guò)去生物學(xué)主要是在認(rèn)識(shí)生物的基礎(chǔ)上研究怎樣利用生物，那么今天已能夠在分子水平上重新設(shè)計(jì)和創(chuàng)建自然界未曾出現(xiàn)過(guò)的基因、蛋白質(zhì)和生物新品種。PrinciplesofGeneEngineering基因工程和有關(guān)的生物技術(shù)為人類(lèi)認(rèn)識(shí)生命世界，認(rèn)識(shí)人類(lèi)自己提供了有效手段。（1）人類(lèi)基因組計(jì)劃與后基因組時(shí)代（2）生物的發(fā)育之謎，如何從一個(gè)受精卵發(fā)育成一成熟的個(gè)體？（3）人類(lèi)的大腦活動(dòng)規(guī)律之謎？PrinciplesofGeneEngineering在基因工程的帶動(dòng)下，有關(guān)的生物技術(shù)得到迅速發(fā)展，構(gòu)成了一個(gè)新興的綜合技術(shù)領(lǐng)域，它們運(yùn)用生命科學(xué)和鄰近基礎(chǔ)學(xué)科的知識(shí)，并結(jié)合工程學(xué)的現(xiàn)代技術(shù)，成為巨大的生產(chǎn)力。一批以生物技術(shù)為基礎(chǔ)的新產(chǎn)業(yè)群得以迅速興起。這些產(chǎn)業(yè)能為社會(huì)提供大量商品和各種社會(huì)服務(wù)．創(chuàng)造出龐大的財(cái)富，其發(fā)展規(guī)模更是始料不及的。它們提供的商品或是生物技術(shù)藥物、食品、化工產(chǎn)品、生物材料和加工制品，或是優(yōu)良的生物品種。社會(huì)服務(wù)的含義也很寬，它們產(chǎn)生的直接效果是社會(huì)效益，如疾病診斷和醫(yī)療保健，水的凈化和廢物處理等。PrinciplesofGeneEngineering新技術(shù)革命引起新的產(chǎn)業(yè)革命，促使世界產(chǎn)業(yè)迅速地朝向尖端技術(shù)化、知識(shí)密集化、高增殖價(jià)值化方向發(fā)生結(jié)構(gòu)性的變化。領(lǐng)頭產(chǎn)業(yè)正在更替。當(dāng)今是信息經(jīng)濟(jì)時(shí)代，信息技術(shù)改變了整個(gè)社會(huì)面貌。任何經(jīng)濟(jì)形式都有始有終，都要經(jīng)歷形成、成長(zhǎng)、成熟和轉(zhuǎn)化四個(gè)明確的階段。20世紀(jì)從電訊技術(shù)誕生、計(jì)算機(jī)出現(xiàn)、網(wǎng)絡(luò)的形成到大規(guī)模使用芯片，信息經(jīng)濟(jì)進(jìn)入了它的成熟階段。