迷迭香酸對大鼠gf-

膜增生性腎炎（mspgb）是腎衰竭中最常見的病理類型。以腎系膜細胞增生和微細胞外基質異常積聚為主要病理特征。大量的研究表明，轉化生長因子-β1(TGF-β1）在該疾病的發生發展中發揮了重要作用。迷迭香酸（rosmarinicacid,RA）是一種水溶性的多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、免疫抑制等多種生物學活性。新近研究發現，RA對體外培養的大鼠系膜細胞增殖具有抑制作用，并且對大鼠MsPGN模型、IgA腎病模型也具有保護作用，但其具體作用機制尚不清楚。本研究通過建立大鼠MsPGN模型，探討了RA對該腎炎的保護作用，并進一步觀察了RA對該模型腎組織中TGF-β1表達的影響。1材料和方法1.1青龍山動物繁殖場健康雄性新西蘭大白兔2只，體重2.5kg左右，由南京軍區總院實驗動物中心提供。健康雄性SD大鼠24只，4周齡，體重160g左右，購自南京青龍山動物繁殖場。RA、完全弗氏佐劑及FITC標記的羊抗兔IgG購自美國Sigma公司，TGF-β1多克隆抗體購自美國SantCruz公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG、DAB顯色劑購自北京中山生物技術公司，RNA抽提試劑、M-MLV、Taq酶等購自美國Promega公司。1.2細胞免疫試驗參照文獻報道的方法，4周齡SD大鼠，取其胸腺并制備成一定濃度的單胸腺細胞懸液，與完全弗氏佐劑等體積混勻后，按5×107細胞皮下多點注射免疫新西蘭大白兔，其后每隔2周按1×107胸腺細胞經耳緣靜脈注射加強免疫3次。7周后頸動脈放血并分離血清，大鼠胸腺細胞涂片測定ATS效價，間接免疫熒光法測抗體效價達1∶1280。1.3ras注射時間SD大鼠24只，隨機分為4組，每組6只。對照組（A組）經尾靜脈一次性注射10ml/kg的正常兔血清，模型組（B組）、低劑量RA給藥組（C組）、高劑量RA給藥組（D組）經尾靜脈一次性注射10ml/kg的ATS。從注射ATS當天起，C、D組每天灌服不同劑量的RA，分別為25mg/kg及50mg/kg，連續7天；A、B兩組分別灌服等量的生理鹽水。從ATS注射當天（第0天）起，用代謝籠隔日（分別為第1、3、5、7天）收集大鼠24h尿液，檢測24h尿蛋白總量。第8天集中處死所有大鼠，留取腎臟。1.4病理組織學觀察采用考馬斯亮藍法測定24h尿蛋白總量，PAS染色法對腎組織切片（3μm）進行病理形態學觀察。每張切片高倍鏡下隨機選取10個腎小球，對腎小球內有核細胞進行計數,并采用捷達病理圖像分析系統軟件測定腎小球系膜區面積及腎小球面積。1.5tgf-1和參與-actin基因檢測采用RT-PCR法檢測腎組織中TGF-β1mRNA的含量。具體方法如下：取腎臟皮質部分組織約100mg，用TRIzol一步法提取細胞總RNA，紫外分光光度計測其純度及含量。取總RNA2μg逆轉錄為cDNA，然后進行PCR擴增，反應體系20μl。TGF-β1基因上游引物：上游引物：5′-CCGCAA-CAACGCAATCTATG-3′，下游引物：5′-GCCCTG-TATTCCGTCTCCTT-3′，產物長度304bp；內參β-actin基因上游引物：5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物：5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′，產物長度452bp，由武漢英駿生物技術有限公司合成。PCR擴增條件：95℃預變性5min,94℃變性30s,56.5℃退火40s,72℃延伸30s，循環30次，72℃終末延伸7min。所選用PCR反應的模板量及循環數均使PCR產物量位于反應曲線的線性范圍內。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，UVP凝膠圖像掃描系統進行分析，以TGF-β1與β-actin比值×100表示其相對含量。實驗重復3次，取其均數。1.6免疫總nb-dab-pbs將正常羊毛魚采用免疫組化（間接法）技術檢測大鼠腎組織中TGF-β1的表達情況。腎組織切片為4μm，具體步驟如下：(1)切片脫蠟至水；(2)微波抗原修復15min,PBS水洗3次×5min；(3)滴加3%過氧化氫，室溫10min,PBS水洗3次×5min；(4)滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min；(5)滴加適當比例稀釋（1100）的一抗工作液，4℃過夜；(6)37℃復溫45min,PBS水洗3次×5min；(7)滴加適當比例稀釋（1200）的辣根過氧化酶標記的二抗工作液，37℃1h,PBS水洗3次×5min；(8)DAB顯色5min,HE復染，脫水、透明、封片。PBS替代一抗作陰性對照。陽性物質呈棕色顆粒狀。每張切片高倍鏡下隨機選取10個腎小球，采用病理圖像分析系統軟件計算陽性指數（PI）[PI=陽性信號面積×平均陽性強度（平均灰度值）/腎小球面積]，取其均值。1.7統計學分析結果以均數±標準差表示，采用SPSS11.5統計軟件進行統計學分析。組間比較采用單因素方差分析，多個均數之間的比較采用q檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。2結果2.1ra對大鼠模型24小時尿蛋白總量的影響2.2c組小鼠肝腎組織結構PAS染色光鏡下，A組腎小球無明顯改變；B組腎小球系膜細胞和系膜基質重度彌漫性增生，增生的系膜組織呈結節狀聚集，腎小球毛細血管腔閉塞；C組系膜細胞和系膜基質節段性增生，大部分毛細血管管腔開放良好；而D組大部分腎小球已基本接近正常。圖像分析顯示模型組腎小球內有核細胞總數、系膜區面積及腎小球面積均明顯高于對照組（P<0.01），兩給藥組腎小球內有核細胞總數、系膜區面積及腎小球面積均明顯低于模型組（P<0.01；圖1，見封二；表2）。2.3ras對ras-ras后腎皮質tgf-m1rna表達的影響與A組相比，模型組腎皮質中TGF-β1mRNA表達明顯升高（P<0.01）。高劑量RA給藥7天后，腎皮質中TGF-β1mRNA表達較模型組明顯下調(P<0.01),與A組相比,差異無統計學意義(P>0.05;圖2,表3)。2.4兩rai對小鼠足跖部tgf-1表達的影響免疫組化結果顯示,正常大鼠TGF-β1少量表達于腎小球毛細血管袢及系膜區,而模型組毛細血管袢及系膜區的TGF-β1表達明顯增多(P<0.01);兩RA給藥組腎小球TGF-β1表達較模型組均有明顯下降（P<0.01）。高劑量組與正常對照組TGF-β1表達量無明顯差異（P>0.05）。此外，腎皮質及髓質小管基底膜、小管間質亦有一定量的TGF-β1表達（圖3，見封二；表4）。3ra的病理改變及作用機制MsPGN是我國兒童腎小球疾病中最常見的病理類型，腎活檢中約占腎小球疾病的36%。光鏡下主要表現為腎小球系膜細胞的增生和（或）系膜基質的增多。Thy1.1抗原為鼠類胸腺細胞表面的糖蛋白，同樣存在于大鼠系膜細胞表面，抗Thy1.1抗體誘發的系膜增生性腎炎是目前公認的研究MsPGN的最佳動物模型。本研究應用ATS注射大鼠尾靜脈后第1天，大鼠24h尿蛋白排泄量即達到13.94mg/24h，第3天達到高峰，隨后逐漸下降。第8天大鼠腎臟病理形態學檢查發現腎小球系膜細胞和系膜基質明顯增殖，表明大鼠MsPGN模型制備成功。TGF-β1是腎小球硬化、腎間質纖維化中重要的調節因子，與細胞外基質沉積密切相關。TGF-β1通過增加細胞外基質蛋白合成、抑制基質降解酶的生成，從而促進細胞外基質的積聚。大量的研究證實，人類多種原發性及繼發性腎疾病，如糖尿病腎病、IgA腎病、局灶性節段性腎小球硬化、新月體性腎小球腎炎、狼瘡性腎炎等，均檢測到TGF-β1的表達增加，進一部證實了TGF-β1在腎臟疾病的發生發展中發揮了關鍵作用。在大鼠MsPGN模型中，本研究同樣發現TGF-β1的表達異常增高，并且其主要沉積于增生的系膜基質以及毛細血管壁中，與OkudaS等報道相一致。研究表明，RA是一種具有多功能的天然活性物質，具有抗氧化、抗炎、抗菌、免疫調節等廣泛的藥理學作用。MakinoT等研究發現，RA對血小板源生長因子（PDGF）誘導的大鼠系膜細胞增殖具有顯著的抑制作用。利用大鼠MsPGN模型研究也發現RA能提高腎皮質中超氧化物歧化酶（SOD）的活性，抑制纖維連接蛋白及Ⅳ型膠原等細胞外基質的產生，從而對該模型起到治療作用。以上研究結果均提示，RA對腎小球系膜細胞的增生及系膜基質的異常積聚具有確切的抑制療效，但其進一步的作用機制目前尚未見報道。本研究發現，給大鼠MsPGN模型灌服RA25mg/kg，連續7天后，大鼠的尿蛋白水平較模型組顯著下調，腎臟病理形態學發現腎小球內有核細胞數、系膜基質以及腎小球體積較模型組均有明顯改善；而50mg/kg劑量的RA治療7天后，病理形態學檢查發現腎小球的結構已基本接近正常，表明RA對大鼠MsPGN腎炎具有較好的治療作用。同時作者也發現，兩種劑量的RA治