缺氧誘導因子1在腎間質纖維化中的表達及意義

根據最近的研究，缺損可能是慢性腎衰竭的一個共同機制。許多慢性腎臟病的動物模型中均已發現存在明顯的腎內缺氧。因此,英國學者Fine提出了進行性腎損害的可能機制——“慢性缺氧學說”。該學說提出,腎小管間質部分的慢性氧缺失是促進腎臟疾病進展和纖維化的重要原因,體外實驗證明缺氧可刺激腎小管上皮細胞和間質成纖維細胞向肌成纖維細胞表型轉分化,參與腎間質纖維化的發生發展,缺氧主要通過缺氧誘導因子1α(hypoxia-induciblefactor1α,HIF-1α)發揮作用。本研究旨在通過動物實驗探討HIF-1α在慢性腎間質纖維化中的作用及六味地黃丸對其表達的影響。材料和方法1材料表面1.1動物SPF級雄性SD大鼠30只,體重180～200g,由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供并飼養于湖南中醫藥大學SPF級動物房。1.2湖南科技第一附屬醫院六味地黃丸(熟地黃24g,山藥12g,山茱萸12g,澤瀉9g,茯苓9g,牡丹皮9g)購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科。先將藥材用相當于藥材5倍的自來水浸泡2h煮沸后再微火煎熬30min,過濾后收集煎液,原藥渣加少量水煎煮,取二煎液。將兩煎液混合,于水浴恒溫器上濃縮為每毫升藥液含生藥1g。1.3試驗動物及試劑一抗為兔抗大鼠HIF-1α、PAI-1和TIMP-1多克隆抗體,美國SantaCruz;兔二步法免疫組化檢測試劑盒(PV-6001)、二抗為山羊抗兔,北京中杉金橋;DAB顯色試劑盒,武漢博士德;ECL化學發光試劑,美國Pierce。2方法2.1腎損害內固定SD大鼠適應性喂養1周后隨機分為假手術組、模型組、六味地黃丸組,每組各10只。模型組、六味地黃丸組均在無菌條件下進行5/6腎切除術,以10%水合氯醛麻醉大鼠0.3ml/100g腹腔注射麻醉動物,常規消毒鋪巾,從左腹部切口,打開腹腔,靜脈夾夾住腎蒂后切除左腎上下極(切除2/3),以明膠海綿壓迫止血,復位腎臟。1周后進行第2次手術,切除右側腎臟。假手術組采取同樣步驟,打開腹腔暴露腎臟后避免牽拉腎臟,不切除腎臟。右腎摘除術后第2天,六味地黃丸組予以六味地黃丸灌胃(生藥含量按公式:人的劑量×0.018×5/kg體重計算),每天1次,至處死為止;模型組、假手術組以等容積蒸餾水灌胃,給藥8周后全部處死。2.2腎組織病理學檢測各組大鼠分別于第8周處死,以10%水合氯醛麻醉大鼠0.3ml/100g腹腔注射麻醉動物,常規消毒鋪巾,打開腹腔,結扎后摘取腎臟。腎組織分為兩部分處理:(1)光鏡觀察:標本用4%多聚甲醛固定、4℃保存,按常規脫水、透明、包埋,石蠟切片3～4μm,分別進行HE染色、Masson染色及HIF-1α、PAI-1和TIMP-1免疫組化檢測。(2)腎組織取出后立即放入液氮罐中,隨后轉入-80℃冰箱保存待用。2.3腎組織病理學檢測腎組織經4%多聚甲醛固定過夜,梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(厚度為3～4μm)后,常規HE染色及Masson染色分析,Olympus顯微鏡觀察腎組織病理變化并拍照。2.4免疫二抗鼠抗體pai-1和timp-1免疫組化PV二步法染色,一抗用兔抗大鼠HIF-1α、PAI-1和TIMP-1抗體,二抗用相應羊抗鼠抗體(工作濃度按產品說明書配制為1∶100或1∶200),染色呈棕褐色或棕黃色者為陽性染色。2.5數碼醫學分析Olympus顯微鏡觀察腎組織病理變化并拍照,每張切片隨機選取5個視野,用麥克奧迪數碼醫學分析系統(MoticMed6.0)進行圖像分析。觀察視野內免疫陽性部分的平均灰度值,半定量法評估,組織細胞平均灰度值愈小,蛋白表達愈高。2.6ecl試劑x線顯色法常規提取蛋白質樣品,BCA法進行蛋白質定量。每泳道50μg蛋白,10%SDS電泳分離后濕轉至PVDF膜,封閉,加一抗雜交,4℃孵育過夜,洗膜。加相應二抗室溫孵育,ECL試劑X線底片上顯色。掃描測定條帶灰度值,以與β-actin的比值作為表達強度。3統計學分析計量資料用(xˉ±s)(xˉ±s)表示,統計學分析采用SPSS18.0統計軟件。組間差異比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。結果1腎組織光度檢查1.1腎組織病理學檢測假手術組大鼠腎組織未見明顯病變,腎小球和腎小管大小、形態正常,結構清晰,間質未見明顯炎細胞浸潤;模型組腎皮質變薄,腎小球系膜細胞明顯增生,硬化增多,部分腎小管明顯萎縮、消失,部分腎小球發生代償性肥大,腎小管發生代償性擴張,可見蛋白管型,腎間質纖維化明顯,大量淋巴細胞浸潤。與模型組相比,六味地黃丸組病理變化明顯減輕,炎細胞浸潤減少,腎小管萎縮及間質纖維化程度減輕。見圖1。1.2腎間質膠原纖維模型組見圖1假手術組腎小球及腎小管僅基底膜染成藍色,腎間質無明顯膠原纖維;模型組腎間質見大量染成藍色的膠原纖維;六味地黃丸組腎間質可見少量膠原纖維。見圖2。2腎組織免疫組化檢測2.1腎皮髓質中hoe-1的表達假手術組HIF-1α微量表達,主要在腎皮髓質交界處,模型組和六味地黃丸組腎小管、間質中HIF-1α均表達增加,而腎小球少有表達。見圖3。2.2各組pai-1表達情況PAI-1主要在腎小管表達,尤以近曲小管刷狀緣明顯,腎小球、間質少有表達,假手術組最弱,模型組最強,六味地黃丸組PAI-1表達較模型組明顯降低。見圖4。2.3timp-1表達TIMP-1主要在腎小管、腎間質表達,尤以近曲小管明顯,而腎小球少有表達,假手術組最弱,模型組最強,六味地黃丸組TIMP-1表達較模型組明顯降低。見圖5。2.4各組大鼠c組,模型組和六味地黃丸組pb腎組織HIF-1α、PAI-1和TIMP-1表達均以模型組最強,六味地黃丸組次之,假手術組最弱,且模型組和六味地黃丸組差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。3兩組患者中機制地黃丸組對兩組實證表1表達持續抬高與假手術組比較,模型組和六味地黃丸組HIF-1α表達持續上調,且模型組高于六味地黃丸組,兩者差異有統計學意義(P<0.01)。見圖6。腎間質纖維化缺氧誘導因子1(hypoxiainduciblefactor-1,HIF-1)是1992年Semenza等在低氧誘導的肝細胞癌細胞株Hep3B細胞核提取物中發現的一種蛋白質,是迄今為止發現的惟一一個在缺氧狀態下發揮活性的特異性轉錄因子。大量研究表明,缺氧激活的轉錄因子HIF-1α在纖維化發展中起至關重要的作用,慢性腎衰竭(chronicrenalfailure,CRF)是各種腎臟疾病持續進展的最終結局,其主要病理學特征為慢性腎臟纖維化。慢性缺氧可誘發HIF-1α持續表達,后者上調一系列促纖維化靶基因表達導致腎臟纖維化。因此,慢性缺氧是引起腎小管間質纖維化的一個關鍵因素,HIF-1α是導致腎間質纖維化的關鍵因子。5/6腎切除大鼠是目前研究慢性腎臟病進展的理想動物模型。目前已有研究表明:5/6腎切除的大鼠腎臟組織中存在小動脈病變,這種小動脈病變可導致腎小球后毛細血管血流減少和小管間質缺血,而缺血就意味著低氧。Manotham等研究證實,在5/6腎切除的大鼠模型中,在發生小管纖維化前,腎小管已存在明顯的缺氧。Zhang等研究5/6腎切除大鼠模型同樣證實,管周毛細血管丟失和腎小管間質缺氧在腎間質纖維化不明顯之前的早期階段(術后第3周)已經很嚴重,并且持續存在于腎間質纖維化的發展過程中。Zeng等應用5/6腎切除大鼠模型探討缺氧有關的腎纖維化,發現HIF-1α在5/6腎切除大鼠腎組織中顯著升高,這一結果證實慢性缺氧存在于5/6腎切除模型。俞小芳等研究5/6腎切除大鼠亦發現在早期階段(術后第1周末),HIF-1α在腎內表達即開始增加,在術后12周仍有持續表達。本研究顯示:5/6腎切除的大鼠模型中,模型組HIF-1α的表達較假手術組明顯升高(P<0.01)。Kimura等通過應用5/6腎切除的基因敲除小鼠模型證實了HIF-1α在腎纖維化中的作用,認為抑制HIF-1α的表達是治療腎臟纖維化的靶點。正常的情況下,細胞外基質(extracellularmatrix,ECM)的生成和降解保持動態平衡。腎臟局部缺血、缺氧及炎癥細胞浸潤時,纖溶酶原激活物/纖溶酶原激活物抑制物(PAs/PAIs)和基質金屬蛋白酶/基質金屬蛋白酶抑制物(MMPs/TIMPs)的表達失衡,致使ECM合成增多,降解減少,使大量ECM沉積于腎間質,形成纖維化。因此,PAI-1和TIMP-1表達升高均可造成ECM的降解減少,從而導致ECM的積聚,這是引起腎間質纖維化的重要原因,已有實驗證明,HIF-1α可上調PAI-1和TIMP-1的表達。六味地黃丸始見于宋·錢乙的《小兒藥證直訣·卷下諸方》,以張仲景《金匱要略》的腎氣丸減桂枝、附子,易干地黃為熟地黃而成。六味地黃丸是臨床上治療腎陰虛證型慢性腎小球腎炎的有效方劑,其臨床運用廣泛,且療效肯定,然其作用機制尚不明了,前期研究已證實:5/6腎切除大鼠在手術后8周,留存腎不可避免地發生了間質纖維化;給5/6腎切除大鼠灌胃六味地黃丸8周后,其血清尿素氮、肌酐的水平明顯低于模型組,并能減少留存腎系膜細胞的增生及間質纖維化,使腎切除大鼠生存期延長。六味地黃丸具有改善5/6腎切除大鼠殘腎腎功能的作用,其改善殘腎腎功能的作用與六味地黃丸提高腎小球的體積密切相關。在本研究