生物制藥第七章發酵工程技術概論第一節概述第二節優良菌種的選育第三節發酵的基本過程第四節發酵方式第五節發酵工藝控制第六節發酵產物的提取第七節發酵設備第八節基因工程在發酵工程中的應用第九節發酵工程的發展展望第一節概述一、發酵工程（fermentationengineering），又稱微生物工程：通過微生物完整的細胞自催化完成生物化學反應過程，微生物既能正常生長又能過量積累目的產物，提供工業產品。包括：抗生素、氨基酸、維生素、有機酸、酶制劑、蛋白質、基因工程藥物、核酸類物質等。抗生素、氨基酸、酶制劑等產品為什么能通過微生物發酵來生產？這與微生物的生長和代謝特點有什么關系？某些微生物因爭奪生存環境或營養物，會產生抗生素將其他種類的微生物殺死。微生物會產生蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶，將營養物質水解成可吸收的小分子多肽或氨基酸、葡萄糖。微生物細胞會通過合成或分解代謝生產它必需的一些物質，包括氨基酸、核苷酸等。二、發酵工程發展的4個階段第一階段---天然發酵階段：發酵技術開始于家庭小制作，傳統的釀酒、制醬等。技術進步緩慢，完全是經驗式的，并不知道其中的原理。1675年荷蘭人列文虎克發明了顯微鏡。法國巴斯德在1857~1876持續研究發酵作用。第二階段---傳統發酵工業階段：開始了解發酵現象的本質，采用開放式的發酵方式，生產過程及設備較為簡單，規模不大。1900~1940人工控制微生物發酵過程（純培養階段），新產品酵母、甘油、乳酸、檸檬酸、丙酮和丁醇（第一個工業發酵產品）第三階段---現代發酵工業階段：通氣攪拌技術階段（深層通氣培養法），技術要求高、發展速度快；生產規模大；菌種生產能力大幅提高，新產品、新技術、新設備的應用達到前所未有的程度。1942年青霉素工業化生產。第四階段---生物技術產業階段：利用基因工程菌進行發酵。三、發酵工程的研究內容生產菌種的培養和選育（菌種）培養基制備和滅菌（培養基）發酵條件的優化與控制（通氣攪拌、溶氧、發酵及條件的優化、發酵過程參數控制、反應器的設計）產物的分離、提取與精制等（純化）發酵工業的生產水平取決于三個要素：

生產菌種、發酵工藝、發酵設備第二節優良菌種的選育一、菌種選育的物質基礎：遺傳物質（DNA）二、自然選育不經過人工處理，利用微生物的自然突變進行菌種選育的過程正變菌株：生長良好、生產水平提高、對生產有利的變異個體負變菌株：生產能力下降、形態出現異性，生產水平下降，菌種退化特點：純化菌種、防止菌種衰退、穩定生產水平、提高產物產量；但效率低、進展慢，通常將自然選育和誘變育種交替使用三、誘變育種

用人工方法來誘發突變是加速基因突變的重要手段，突變部位一般是在遺傳物質DNA上，因此突變后性狀能穩定的遺傳。（一）方法和原理1.誘變機制（1）微小損傷突變：堿基置換、移碼突變（2）染色體畸變：由于遺傳物質的缺失或重排造成（易位、倒位、缺失、重復）（3）染色體組突變：指由有絲分裂或減數分裂異常而產生的染色體數目或組數的變化。2.誘變劑及作用方式：誘變劑：能誘發基因突變并使突變率提高到超過自發突變水平的物理化學因子。（1）物理誘變劑

紫外線、x射線、γ射線、快中子、α射線、β射線和超聲波等。（2）化學誘變劑金屬離子、一般化學試劑、生物堿、抗代謝物、生長刺激素、抗生素、高分子化合物、殺菌劑、染料等。對DNA的作用形式：與一個或多個核酸堿基起化學反應，引起DNA復制時堿基配對的轉換而導致變異；如亞硝酸、硫酸二乙酯等與天然堿基相似的類似物摻入到DNA分子上引起的；如5-溴尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤等DNA分子上減少或增加一兩個堿基引起堿基突變點以下的全部遺傳密碼轉錄和翻譯的錯誤---移碼突變。如吖啶類物質三、誘變育種（二）誘變和篩選誘變---以合適的誘變劑處理細胞懸浮液包括：出發菌株的選擇---誘變劑種類和誘變劑劑量的選擇---合理的使用方法篩選---用合適的方法淘汰負變異株，選出性能優良的正變異株包括：初篩---重復篩選---突變株性能檢測---直到獲得新的優良菌株實用意義較大的初篩方法有以下幾種：自身耐藥突變株：耐受自身分泌的抗生素；開始合成抗生素的時間提早，產量也有所提高結構類似物或前體類似物的耐受突變株：解除反饋抑制，積累過量產物營養缺陷型突變株及其回復突變株：解除反饋抑制、阻斷分支途徑四、原生質體融合原生質體：除去細胞壁的細胞，或是被質膜所包圍的裸露細胞。原生質體融合：指通過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個細胞的原生質體進行融合，借以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩定重組子的過程。1.原生質體融合的一般程序：溶壁作用：細菌、放線菌（溶菌酶）、真菌（蝸牛酶）、霉菌（蝸牛酶、纖維素酶）原生質體在高滲溶液下用PEG作助融劑，將兩種親株原生質體進行融合在選擇培養基上培養，挑出融合重組子2.影響融合的因素

菌齡：一般采用對數前期的菌體，原生質體形成率較高培養基成分：在限制性培養基上比在于完全培養基上原生質體形成效果好，可能是由于完全培養基中的有機成分或某些金屬離子會引起細胞壁成分的改變，導致對溶壁酶敏感性的改變。PEG：相對分子質量（4000或6000）、濃度（30~40%）外界因素：高滲溶液配制、再生培養基中加入酵母膏促進再生速度、原生質體密度要適當3.原生質體融合育種意義：打破了微生物的種界界限，可實現遠緣菌株的基因重組。可使遺傳物質傳遞更為完整、獲得更多基因重組的機會。去除了細胞壁屏障，融合重組頻率比較高。可與其他育種方法相結合，如把常規誘變和原生質體誘變所獲得的優良性狀，組合到一個單株中。用途：改良菌株，提高代謝產物的產量，打破種屬界限、產生重組子，有可能產生新的化合物。第三節發酵的基本過程

菌種---種子制備---發酵---發酵液預處理---提取精制

一、菌種對生產菌種的要求：產量高、生長快、性能穩定、容易培養生產菌種的保存：0~4℃休眠保存，砂土管或冷凍干燥管二、種子的制備使菌種繁殖，獲得足夠數量的菌體，以便接入發酵罐中三、發酵使微生物產生大量的目的產物，是發酵的關鍵階段。參數：通氣量、攪拌轉速、罐壓、罐溫、培養基總體積、黏度、泡沫、菌絲形態、pH、溶氧濃度、排氣中二氧化碳含量等四、產物提取發酵液的預處理和過濾，提取，精制第四節發酵方式一、分批發酵將全部物料一次投入到反應器中，經滅菌、接種、發酵后再將發酵液一次放出的操作過程。特點：（1）整個培養系統與外界沒有其他物質交換（O2、CO2、消泡劑、酸堿除外）（2）整個過程中菌的濃度、營養成分的濃度和產物濃度不斷變化，是一種非穩態的培養方法

分批培養的優缺點優點：操作簡單，周期短，染菌機會少，生產過程和產品質量容易掌握。缺點：產率低應用廣泛，改善中（在線監測，計算機控制）二、連續發酵微生物培養到對數生長期時，在發酵罐中不斷添加新鮮的培養基，同時不斷放出代謝物，使微生物在近似恒定狀態下生長的培養方式。特點：菌濃度、產物濃度、限制性基質濃度均處于恒定狀態。應用在廢水處理、葡萄糖酸發酵、酒精發酵等工業中連續發酵的優缺點優點：操作穩定，利于機械化、自動化；控制稀釋速率可以使發酵過程最優化，發酵周期長，產量高缺點：長期連續發酵會引起菌種退化，降低產量，染菌機會增加，對產品類型的適應性不廣，對設備及附件要求高三、補料分批發酵將種子接入發酵反應器中進行培養，經過一段時間后，間歇或連續補加新鮮培養基，使菌體進一步生長的培養方法。應用廣泛，用于氨基酸、抗生素等工業補料分批發酵的優缺點優點：與分批發酵相比延長次級代謝產物的生產時間可避免在分批培養過程中因一次性投糖過多造成細胞大量生長，耗氧過多的狀況達到高濃度細胞培養稀釋有毒代謝產物優點：與連續發酵相比因為操作時間有限，降低了染菌，避免了遺傳不穩定性最終產物濃度較高，有利于產物的分離使用范圍廣，在生產次級代謝產物和細胞高濃度培養中普遍采用。

缺點：由于沒有物料取出，產物的積累最終導致生產速率的下降由于物料的加入增加了染菌機會第五節發酵工藝控制一、培養基的影響及其控制碳源：占菌體干物質的50%以上是碳主要功能：提供能源、菌體成分、產物碳架來源：糖類、脂肪、有機酸、碳氫化合物速效碳源：如葡萄糖，能較迅速的參與代謝、合成菌體和產生能量，并產生分解產物，有利于菌體的生長，但有的分解代謝產物對產物的合成可能產生阻遏作用；遲效碳源：如淀粉、乳糖、油脂等，被菌體緩慢利用，有利于延長代