蛋白質免疫印跡技術及常見問題分析張紹進WesternBlot簡介WesternBlot一般流程WesternBlot常見問題分析WesternBlot簡介：印跡法（blotting）是指將樣品轉移到固相載體上，而后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質進行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。WesternBlot基本原理WesternBlot優點

高分辨率的電泳技術特異敏感的抗原-抗體反應1-5ng中等大小的靶蛋白WesternBlot應用目的蛋白的表達特性分析目的蛋白與其它蛋白的互作目的蛋白的組織定位目的蛋白的表達量分析WesternBlot流程蛋白樣品的制備SDS轉膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色通過有機溶劑或水溶法制備總蛋白水溶液提取法針對水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質。稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑。有機溶劑提取法對于分子中非極性側鏈較多的蛋白質可用有機溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通過層析或電洗脫法制備目的蛋白蛋白樣品的提取蛋白樣品的定量目前常用比色法測定樣品蛋白的含量：Bradford法（考馬斯亮藍法）、Lowry法（Folin-酚試劑法）、BCA法等。但各有優缺點，大家可以根據具體情況選取。按相應蛋白質定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。蛋白質濃度測定的各種方法匯總：/thread-23639-1-1.html蛋白樣品的變性2×SDS上樣緩沖液：DTT可臨用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分裝，-20℃凍存。按1:1比例與蛋白質樣品混合，95～100℃加熱5～15min，冰上冷卻后再上樣，上樣量一般為20-25μl，總蛋白量20～50μg。1MTris-HCl(pH6.8)10ml1MDTT20mlSDS4g甘油20ml溴酚藍0.2g總體積100ml100mMTris-HCl(pH6.8)200mMDTT4%SDS0.2%溴酚蘭20%甘油ddH2OSDS：陰離子去污劑變性劑氨基酸側鏈與SDS充分結合形成帶負電荷的蛋白質-SDS膠束。蛋白質-SDS膠束所帶的負電荷大大超過了蛋白質分子原有的電荷量，消除了不同分子之間原有的電荷差異。與強還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開，使蛋白質分子線性化。蛋白質-SDS膠束的特點：（1）具有相同的形狀，形狀像一個長橢圓棒

（2）平均1g蛋白質結合1.4gSDS（3）短軸對不同的蛋白質亞基-SDS膠束基本上是相同的（4）長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比不連續的電泳緩沖體系。SDS—蛋白質復合物在凝膠電泳時，不再受蛋白質電荷與形狀的影響，而只取決于蛋白質分子量的大小。

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS

是在蛋白質樣品中加入SDS和含有巰基乙醇的樣品處理液，SDS是一種很強的陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內和分子間的氫鍵，破壞蛋白質分子的二級和三級結構。強還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，DTT）可以斷開二硫鍵破壞蛋白質的四級結構。使蛋白質分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側鏈與SDS充分結合形成帶負電荷的蛋白質-SDS復合物。蛋白質分子結合SDS陰離子后，所帶負電荷的量遠遠超過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質之間所帶凈電荷的差異。蛋白質的電泳遷移率主要決定于亞基的相對分子質量，而與其所帶電荷的性質無關。【SDS基本原理】凝膠成分丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺

SDS配膠的Tris緩沖液TEMED過硫酸銨Tris-甘氨酸電泳緩沖液PAGE：聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamidegel)是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯劑(crosslinker)N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，簡稱Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯而成的三維網狀結構的凝膠。化學惰性強，具有一定的機械強度和透明度。是良好的電泳介質。聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式：單體：丙烯酰胺（Acr）；交聯劑：甲叉雙丙烯酰胺（Bis）；催化劑：過硫酸胺或核黃素（AP）；加速劑：四甲基乙二胺（TEMED）；產物：三維網狀結構凝膠聚丙烯酰胺凝膠聚合機理是通過提供氧游離基(freeradicals)的催化，使體系發生氧化還原作用(catalyst-redoxsystems)來完成的。催化體系主要有化學催化（AP—TEMED）和光化學催化（核黃素——TMTED）體系。凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（％）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212SDS濃縮膠(5%Acrylamide)及分離膠配方表：/thread-20726-1-1.html

不連續電泳：

作用緩沖液PH凝膠濃度濃縮膠使蛋白樣品濃縮pH6.8Tris-Cl低，2-5%分離膠使蛋白樣品分離pH8.8Tris-Cl高，根據蛋白大小電泳緩沖液：pH8.3Tris-甘氨酸系統。灌制分離膠隔絕空氣ddH2O0.1%SDS:<8%異丁醇：>8%灌制積層膠插入梳子StakinggelSeparatinggel轉膜要將電泳后分離的蛋白質從凝膠中轉移到固相載體（例如NC膜）上，通常有兩種方法：毛細管印跡法和電泳印跡法。常用的電泳轉移方法有濕轉和半干轉。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場的機械裝置不同。轉移膜的選擇最常用于WesternBlot的轉移膜主要是硝酸纖維素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯（PolyvinylideneFluoride,PVDF）膜，此外也有用尼龍膜、DEAE纖維素膜做蛋白印跡。尼龍膜和NC膜的特點相似,主要用于核酸雜交。各種膜的詳細特點介紹：/bio101/2008/21461_2.htm濕轉系統半干轉移系統麗春紅染色蛋白帶出現后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。印度墨汁染色

只用于放射性標記抗體或放射性標記A蛋白探針的Western印跡過程。轉膜后檢測（此步可以省略）封閉為避免作為檢測試劑的特異性第一抗體與膜發生非特異性結合，使非特異性背景提高，需對膜上的潛在結合位點進行封閉處理。5%脫脂奶粉或BSA（室溫孵育1h）WesternBlot膜封閉液（生物試劑公司）Tween-20的作用：減少非特異性吸附，不影響抗體與抗原的結合。一抗、二抗孵育把NC膜放在密閉塑料袋或者培養皿中，根據膜面積以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，搖床上平緩搖動，于室溫孵育1-2小時或4℃過夜。回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動，于室溫孵育1-2小時或4℃過夜。回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。二抗與底物反應顯色辣根過氧化物酶法（HRP）堿性磷酸酶法（AP）化學發光顯色法(HRP)膜解吸方法（膜的重復利用）

通過加熱和去污劑進行解吸

原理：組合使用去污劑和加熱使抗體解離，適用于任何化學發光底物系統。酸解吸

原