第十一章

轉基因技術講課人：何劍雄第一節概述第二節轉基因技術的原理與方法第三節外源基因的整合、表達與遺傳第四節外源基因的檢測第五節轉基因水產動物的安全性第一節概述（一）轉基因技術的發展1953年沃森和克里克提出DNA雙螺旋結構1973年科恩和伯耶一道將外源基因拼接在質粒中，并在大腸桿菌中表達，揭開基因工程的序幕20世紀70年代末用微生物來生產人的胰島素和干擾素等產品1982年科學家將大鼠的生長激素基因轉入小鼠體內，培育出具有大鼠雄健體魄的轉基因小鼠及其子代（二）轉基因技術在水產動物育種中的應用轉基因：指在DNA操作過程中整合到動植物受體細胞染色體上的外源基因。1、轉基因技術與傳統育種技術共同點：本質都是通過獲得優良基因對目標動、植物進行遺傳改良不同點：（1）、傳統雜交和選擇技術一般是在個體水平上進行，不能對某個基因進行操作選擇，選出優良遺傳性狀的概率極低，且花費時間很長。轉基因技術操作和轉移的是明確的基因，功能清楚，其表現可準確預測，花費時間短（2）、傳統育種技術只能在種內個體間實現基因轉移，轉基因技術不受生物體間親緣關系的限制2、在水產動物育種中的應用方面（1）、改良養殖性能，如加快生長，提供飼料利用率及抗逆性（2）、生產醫藥生物制品，如生產珍貴蛋白質（3）、培育新型觀賞魚或其他用途，如各種顏色的熒光斑馬魚3、魚類轉基因研究魚類是脊椎動物中較原始的類群，且魚類可塑性強，不同種屬之間親合和協調較容易，是進行轉基因研究的理想材料。1985年朱作言首先進行魚類轉基因研究，將小鼠重金屬結合蛋白基因啟動子與人生長激素基因序列的重組DNA片段，注入鯉、鯽和泥鰍的受精卵中。后又克隆鯉和草魚肌動蛋白基因，獲得其啟動子，和草魚的生長激素基因組合成全魚基因，導入鯉和銀鯽。1993年孫效文構建轉鯉MT啟動子-大麻哈魚生長激素基因這一全魚融合基因鯉。4、蝦類轉基因研究1992年孔杰首先成功運用精子介導外源基因轉移到中國對蝦卵子中1996年劉萍將羊生長激素基因導入中國對蝦受精卵2000年劉志毅用基因槍法獲得具有綠色熒光蛋白基因表達產物的轉基因對蝦。5、貝類的轉基因研究首例報道：利用電脈沖導入法將魚生長激素基因導入去膜的貽貝受精卵內，結果表明陽性率到達41%。2000年lin利用一個新的轉基因載體將外源基因導入短勁蛤中，并且利用同一載體將鮭生長激素基因導入海灣扇貝受精卵，在子代中檢測到此導入基因。第二節轉基因技術的原理和方法生產轉基因動物的主要技術包括外源基因的構建、外源基因有效地導入生殖細胞或胚胎干細胞、外源基因的表達與檢測等。一、外源基因的構建包括：啟動子、目的基因、轉錄終止信號（一）啟動子RNA聚合酶特異性識別和結合的DNA序列，和增強子一起構成基因轉錄的順式作用原件，控制基因表達（轉錄）的起始時間和表達的程度。啟動子就像“開關”，決定基因的活動。1、來自高等動物病毒基因的啟動子轉基因研究早期，使用的啟動子大多為病毒啟動子，如SV40、RSV等2、來自高等動物的啟動子和增強子早期使用較多的是高等動物金屬硫蛋白基因（MT）的啟動子3、來自魚類基因的啟動子可使外源基因有較高水平的表達或表達組織特異性、時期特異性。（二）目的基因1、選擇目的基因的原則（1）改變受體的代謝特征：目的基因的表達應該對受體水產動物的代謝產生重要影響（2）改變受體對環境適應能力：目的基因的表達能夠改變受體水產動物的環境適應能力，增強抗逆性，使受體水產動物表現出抗病、耐寒或者耐高溫等特性2、常用目的基因（1）生長激素基因：生長激素的主要生理功能是促進神經組織以外的所有其他組織生長；促進機體合成代謝和蛋白質合成；促進脂肪分解；抑制葡萄糖利用而使血糖升高等作用。魚類基因轉移的第一個熱點。魚類是人類主要蛋白質來源之一C很多動物的生長激素基因序列都已研究清楚，為各種動物基因轉移的研究和實踐準備好現成材料很多實驗結果表明，向魚類轉移生長激素基因，如果能夠整合和表達，對魚的生長就會有促進作用（2）增強抗逆性的基因：抗逆性是指生物對不良環境的抵抗能力，包括抗病、抗寒、抗高溫和耐低溶氧等。抗凍蛋白基因：具有降低胞內溶液凝固點的作用。抗病性基因：將抗病相關基因導入魚體內，可達到增強魚抵御各種病害能力的目的。珠蛋白基因：魚類耐低溶氧能力主要是由紅細胞內的血紅蛋白決定的，而血紅蛋白的合成是由珠蛋白基因編碼和調控的。（3）報告基因：是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因。需具有的條件：已被克隆和全序列已測定表達產物在受體細胞中不存在所編碼的產物的檢測應該快速、簡便、靈敏度高而且重現性好。廣泛應用于啟動子分析、監控轉基因及其表達、細胞的信號轉導與藥物的篩選。二、外源基因的導入（一）魚類基因轉移中外源基因的導入方法1、顯微注射法:是借助于顯微鏡的放大技術，直接把外源基因注射到動物的卵母細胞、受精卵、早期胚胎、胚胎干細胞或體細胞中，然后生產動物個體的方法。（1）卵母細胞核注射（2）受精卵原核或胞質注射影響因素：外源DNA的濃度、外源DNA的結構、注射位點以及動物品系和注射的時期2、電穿孔法原理：利用外部高壓短脈沖使細胞膜的結構改變，使之產生可逆的孔隙或孔洞，一定大小的分子包括DNA即可通過孔隙或孔洞進入細胞。優點：操作較簡單，可同時處理處理大量的受精卵缺點：導入時隨機的，無定向的，且轉移率較低，針對不同種魚需建立對應的電脈沖條件。3、精子載體法以精子作為外源基因的載體，通過人工受精將外源基因導入動物胚胎，從而將外源基因帶入子代的基因組中而實現基因轉移。（1）直接混合法:是在受精前將精子直接加入事先配好的保存液中，然后與外源基因混勻，溫育半小時后按常規方法受精。（2）脂質體法：是將外源DNA與精子混合培養之前先用脂質體包裹，脂質體自發地與DNA相互作用形成脂質體DNA復合體。（3）電穿孔法：是利用高電壓暫時地破壞精子質膜，從而外源DNA比較容易地進入受體細胞內而實現基因轉移。4、基因槍法：是通過把吸附DNA的金屬微粒高速打入受體細胞內，從而使外源基因導入受體細胞內的方法。優點：短期內處理多個個體。缺點：在外源基因的