第一實驗：酵母雙雜交（YeastTwo-Hybrid）目的掌握酵母雙雜交原理和方法。利用酵母雙雜交方法在擬南芥轉錄因子AP2-EREBP家族中篩選與擬南芥Med25有相互作用的蛋白。原理酵母雙雜交系統由Fields和Song等首先在研究真核基因轉錄調控中建立。典型的真核生物轉錄因子，如GAL4、GCN4等都含有二個不同的結構域:DNA結合結構域(DNA-bindingdomain，DBD)和轉錄激活結構域(transcription-activatingdomain，AD)。DNA結合結構域可識別DNA上的特異序列，并使轉錄激活結構域定位于所調節的基因的上游，轉錄激活結構域可同轉錄復合體的其他成分作用，啟動它所調節的基因的轉錄。二個結構域可在其連接區適當部位斷開，仍具有各自的功能。將兩個待測蛋白分別與這兩個結構域組成融合蛋白，并共表達于同一個酵母細胞內。如果兩個待測蛋白間能發生相互作用，就會通過待測蛋白的橋梁作用使AD與DBD形成一個完整的轉錄激活因子并激活相應的報告基因表達。通過對報告基因表型的測定可以知道待測蛋白分子間是否發生了相互作用。圖SEQ圖表\*ARABIC1-1酵母雙雜交基本原理酵母雙雜交系統在發展中增添了接合型酵母雙雜交和反向酵母雙雜交系統。其中接合型雙雜交系統就是已預先將文庫轉化了某個接合型的單倍體酵母，然后再和轉化了誘餌質粒的相反接合型的單倍體進行接合，形成二倍體，并檢測報告基因的表達。酵母雙雜交系統由三個部分組成：(1)與DBD融合的蛋白表達載體，被表達的蛋白稱誘餌蛋白(bait)。(2)與AD融合的蛋白表達載體，被表達的蛋白稱靶蛋白(prey)。(3)帶有一個或多個報告基因的宿主菌株。常用的報告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株則具有相應的缺陷型。雙雜交質粒上分別帶有不同的抗性基因和營養標記基因。這些有利于實驗后期雜交質粒的鑒定與分離。酵母雙雜交系統常應用在：(1)研究兩個已知蛋白是否存在相互作用，同一蛋白是否有自身相互作用以及相互作用的分子區域。(2)用已知功能的蛋白做誘餌，在cDNA文庫中尋找有相互作用的未知蛋白，以獲取蛋白質相互作用的網絡途徑信息。(3)以功能未知的新蛋白去篩選文庫，根據選到的靶蛋白的已知功能來推測該新蛋白的功能。(4)建立蛋白質相互作用的圖譜。使用酵母雙雜交系統應注意如下問題：(1)在篩選文庫之前，要檢測誘餌質粒轉化后表達的誘餌蛋白本身能否激活報告基因。(2)由于誘餌蛋白的存在致使報告基因His產生滲漏表達（leaky）。一般情況下，在培養基中加入3-AT（3-amino-1,2,4-triazole）可以有效地抑止His報告基因的滲漏表達。(3)在完成篩選之后，需檢測獵物蛋白是否自激活。一個完整的利用酵母雙雜交篩選相互作用蛋白的實驗包括cDNA文庫的構建，誘餌基因載體構建，載體轉化酵母，報告基因滲漏表達滴定，酵母接合實驗，報告基因表型的測定，誘餌蛋白與靶蛋白相互作用復驗。本實驗只完成酵母接合實驗，報告基因表型的測定。在本實驗中，pDEST32質粒攜帶誘餌蛋白MED25，營養標記基因是Leu2，轉化到釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）AH109（Mata，trp1-901，leu2-3，112，ura3-52，his3-200，gal4△，gal80△，LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3，GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2，URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ，MEL1）菌株中；pDEST22質粒攜帶的靶蛋白文庫來自擬南芥轉錄因子，營養標記基因是Trp1，轉化到釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）Y187（MATαura3-52,his3-200,ade2-101,trp1-901,leu2-3,112,gal4Δ,met–,gal80Δ,MEL1,URA3::GAL1UAS-

GAL1TATA-lacZ）菌株中。報告基因使用HIS3。誘餌載體和獵物載體的啟動子都是酵母組成型強啟動子ADH。其中，擬南芥轉錄因子庫是組分特異的庫（specificlibraries），相對傳統全cDNA庫而言，它不受組分的組織表達特異性、發育階段特異性以及表達量低的影響，提高了篩選效率。該庫由1000多個獨立的克隆組成，篩選后不需測序。圖1-SEQ圖表\*ARABIC2實驗材料示意材料、試劑、儀器材料酵母菌株AH109含有pDEST32-bait質粒(Leu)酵母菌株Y187（Matα）含有pDEST22-prey質粒(Trp)，共有4個不同基因酵母菌株Y187（Matα）含有pDEST22空質粒(Trp)試劑液體YPAD培養基30ml液體SD-Trp培養基30ml液體SD-Leu培養基5ml固體SD-Trp-Leu培養基30ml固體體SD-Trp-Leu-His培養基30ml滅菌水30ml如上培養基需121℃滅菌15分鐘。儀器30℃的恒溫搖床，30℃的恒溫培養箱，電子天平，pH計；量筒（10ml，100ml），燒杯（50ml，100ml），玻璃棒，1000ul移液器,200ul移液器,20ul移液器。滅菌的1000ul、200ul吸頭，滅菌的10ml試管，滅菌的1.5ml離心管，滅菌平皿。操作實驗準備滅菌：各種培養基，蒸餾水約30ml，10ml試管約10支，1.5ml離心管約20個，200ul和1000ul吸頭各半盒。培養酵母挑酵母AH109（pDEST32-Med25）單菌落，以3mlSD-Leu培養基培養過夜。培養條件：30℃，200rpm。選含有擬南芥轉錄因子AP2-EREBP家族的3個基因的酵母Y187（pDEST22-TF）單菌落，分別以3mlSD-Trp培養基培養過夜。培養條件：30℃，200rpm。挑酵母Y187（pDEST22空載體）單菌落，以3mlSD-Trp培養基培養過夜。培養條件：30℃，200rpm。圖1-SEQ圖表\*ARABIC3基本實驗流程酵母接合在4個新試管中分別加入2.8mlYPAD培養基，各加100ul誘餌蛋白的菌液，再分別加入100ul各靶蛋白及對照的菌液，混勻，30℃，200rpm培養16-24小時。在篩選培養基上培養接合后的酵母取酵母菌液，用滅菌水稀釋到1/10，點到篩選培養基SD-Trp-Leu和SD-Trp-Leu-His平板上，每個點5ul。觀察實驗結果第二周周一觀察實驗結果，做實驗記錄，并給老師登記，清理用過的平皿。注意事項注意無菌操作。菌株與培養基要匹配注意培養基不可相互污染。實驗提示如果誘餌質粒轉化后表達的誘餌蛋白本身能激活報告基因，可以用什么方法繼續尋找與之相互作用的蛋白？附錄=1\*ROMANIYPAD培養基（改良完全培養基，用于酵母常規培養）YeastExtract10gTryptone20gGlucose20gAdenineSulfate100mgAutoclaved,distilledH2O定容1liter用HCl調pH到6.0，121°C滅菌15分鐘。SD-Trp培養基（缺陷型培養基syntheticdrop-out）YNB（Yeastnitrogenbase）6.7gSD-Trp0.74gGlucose20g2MNaOH1000ulAutoclaved,distilledH2O定容1literSD-Leu培養基YNB（Yeastnitrogenbase）6.7gSD-Leu0.69gGlucose20g2MNaOH1000ulAgar20gAutoclaved,distilledH2O定容1literSD-Trp-Leu培養基YNB（Yeastnitrogenbase）6.7gSD-Trp-Leu0.64gGlucose20g2MNaOH1000ulAgar20gAutoclaved,distilledH2O定容1literSD-Trp-Leu-His培養基YNB（Yeastnitrogenbase）6.7gSD-Trp-Leu-His0.62gGlucose20g2MNaOH1000ulAgar20gAutoclaved,distilledH2O定容1liter附錄=2\*ROMANII參考書目：Ou,B.,etal.(2011).AHigh-ThroughputScreeningSystemforArabidopsisTranscriptionFactorsandItsApplicationtoMed25-DependentTranscriptionalRegulation.MolecularPlant1–10Riechmann,J.L.,etal.(2000).Arabidopsistranscriptionfactors:genome-widecomparativeanalysisamongeukaryotes.Science.290,2105–2110.Fields,S.,andSong,O.-k(1989).Anovelgeneticsystemtodetectprotein–proteininteractions.Nature.340,245–246附錄=3\*ROMANIII酵母轉化（簡化版，非正規）材料AH109酵母，pDSET32-Med25質粒。試劑YPAD液體培養基，SD-Leu固體培養基，滅菌水，PEG/LiAc懸菌液300ulPEG/LiAc懸菌液：30ul10*TE(pH7.5)30ul10*LiAc240ul50%PEG3350(母液皆過濾除菌)儀器滅菌的1000ul、200ul吸頭，滅菌的10ml試管，滅菌的1.5ml離心管，滅菌平皿。方法挑酵母AH109單菌落，以3mlYPAD30℃培養過夜。5000rpm離心3分鐘，收集菌體，以1-2ml滅菌水重懸。再次5000rpm離心3分鐘，收集菌體。以300ulPEG/LiAc溶液重懸酵母。50ng質粒加到50ul菌液中，42℃水浴1小時，每20分鐘震蕩一次。冰置2-3分鐘，最大轉速離心5秒，棄上清。100ul滅菌水重懸菌體，鋪到合適的固體培養基上。30℃培養2-4天。

第二實驗：DNA的Southern分析DNA的Southern分析是1975年由E.M.Southern建立的DNA雜交方法。本實驗經瓊脂糖凝膠電泳將DNA分離后，通過毛細管作用，把凝膠中的DNA轉移到固相支持膜上，用放射性或熒光等物質標記的單鏈DNA或RNA探針與固定于膜上的DNA雜交，經放射自顯影或顯色等方法確定與探針互補的電泳條帶的位置。實驗目的熟悉DNA印跡技術；學習用地高辛（Dig）標記的探針檢測目的DNA的方法；用地高辛（Dig）-dNTP標記SSG基因的400bp的DNA片段，檢測pBS-SSG的基因DNA。實驗原理DNA通過瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用變性液使DNA在原位發生變性（雙鏈DNA分解為單鏈DNA），再通過毛細管作用、電轉移或真空轉移把凝膠中的DNA轉移到一固相支持膜上，如硝酸纖維素膜或尼龍膜，DNA片段在轉移到固相支持膜的過程中，其相對位置保持不變，用放射性或熒光等標記的單鏈DNA或RNA與固定于膜上的DNA雜交，使具有同源序列的兩條單鏈DNA復性，經放射自顯影或顯色等方法確定與探針互補的電泳條帶的位置。用尼龍膜代替硝酸纖維素膜的優點是，尼龍膜易于處理，對DNA結合效率高而且牢固，特別是在低離子強度的緩沖液中對于低分子量（50bp）的核酸仍有較強的結合能力，另外同一張膜可用不同探針進行多次雜交。實驗材料與試劑實驗材料：電泳設備、尼龍膜、恒溫水浴鍋、電子天平、pH計、雜交儀、80℃烘箱、100℃水浴鍋、小搖床、微量移液器、吸頭（1000μl、200μl）、1.5ml離心管、量筒、燒杯、玻璃棒、大平皿（直徑15cm）、小平皿（直徑9cm）、20cm×15cm玻璃板、紙巾、濾紙、500g重物。Dig標記SSG基因的400bp的DNA片段作為探針，pBS-SSG作為檢測樣品，pBS空載體作為陰性對照。試劑：瓊脂糖：選用高質量的瓊脂糖，使DNA轉膜時凝膠不會被壓碎。1×TAE1000ml：Tris4.84g,冰醋酸1.14ml,EDTA0.29g,定容，pH8.0變性緩沖液30ml.：0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl.中和緩沖液30ml.：0.5mol/LTris.Cl,3mol/LNaCl,pH7.520×SSC300ml：3mol/LNaCl,0.3mol/L檸檬酸鈉，pH7.0.2×洗膜緩沖液：2×SSC，0.1%SDS.0.1×洗膜緩沖液：0.1×SSC，0.1%SDS.10×封閉劑：Roche產品，用顯色緩沖液Ⅰ配成10%（W/V）,加熱助溶，但不能煮沸。顯色緩沖液Ⅰ50ml：0.1mol/L馬來酸，0.15mol/LNaCl，pH7.5顯色緩沖液Ⅱ10ml：用時現配，9ml顯色緩沖液Ⅰ和1ml10×封閉液混勻。顯色緩沖液Ⅲ20ml：0.1mol/LTris.Cl,0.1mol/LNaCl,pH9.5堿性磷酸酶偶聯的地高辛抗體（Anti-Dig-Ap）NBT/BCIP顯色液實驗步驟DNA電泳和轉膜用1×TAE緩沖液配制0.8%的瓊脂糖凝膠，然后向電泳槽內加入1×TAE緩沖液。上樣后用50~70V電壓進行電泳，當溴酚藍距膠邊緣2cm左右時停止。電泳結束后，戴上手套取出膠，切掉一角作為標記。在小培養皿中，用滅菌雙蒸水洗凝膠5min。凝膠浸泡在20ml變性緩沖液中15min，期間緩緩輕搖。滅菌雙蒸水洗凝膠2次，每次5min.凝