感清中間產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準的研究

感覺綠茶是從馬蘭草、鐵剪刀、石鋸、蘭、布正、木槿葉、紫蘇、沙丁魚等草藥中提取的。是治療感冒疾病的民間驗方，目前有糖漿和顆粒劑。具有散寒解表、宣肺止咳的功效，臨床上主要用于風(fēng)寒感冒引起的頭痛、畏寒、發(fā)熱、流涕、咳嗽等癥。為保證糖漿劑與顆粒劑質(zhì)量，有必要對感清中間提取物進行質(zhì)量研究。方中沒食子酸、石吊蘭素均有抗菌、抗病毒的作用、金絲桃苷具有鎮(zhèn)痛，抗氧化，保護心肌、肝臟作用，還具有抗乙肝病毒作用，均為有效成分。本研究以沒食子酸、石吊蘭素、金絲桃苷為評價指標(biāo)，以高效液相色譜法定量測定;以鐵筷子、石吊蘭、藍布正、木芙蓉葉對照藥材，沒食子酸、石吊蘭素、金絲桃苷化學(xué)對照品進行薄層定性鑒別。進一步有效控制感清中間產(chǎn)品的質(zhì)量。1藥品化學(xué)品檢定所需藥物試劑JT—5003電子天平(千分之一);AUW220D電子天平(十萬分之一);HS10260D型超聲波清洗儀;HH—2型數(shù)顯恒溫水浴鍋;ZF—2型三用紫外儀;薄層色譜攝像儀(瑞士卡馬公司);高效液相色譜儀(日本島津/LC—20AT)。石吊蘭素對照品(批號:111555-200602，供定量測定用)，沒食子酸對照品(批號:110831-200803，供定量測定用)，金絲桃苷對照品(批號:CAS482-36-0，供薄層鑒別用，111521-200303，供定量測定用)，木芙蓉葉對照藥材(批號:120965-200703，供薄層鑒別用)，藍布正對照藥材(批號:121380-200401，供薄層鑒別用)，鐵筷子對照藥材(批號:121313-200503，供薄層鑒別用)，石吊蘭對照藥材(批號:121297-201003，供薄層鑒別用)，均購于中國藥品生物制品檢定所。甲醇(HPLC級)、乙腈(HPLC級)，磷酸(分析純)，甲酸(分析純)，三氯甲烷(分析純)，乙酸乙酯(分析純)，水為娃哈哈純凈水，硅膠G薄層板。2樣品制備2.1木芹葉、麻黃馬蘭草75g，鐵筷子60g，石吊蘭50g，藍布正65g，木芙蓉葉50g，紫蘇50g，荊芥50g。藥材由貴州百靈企業(yè)集團制藥股份有限公司提供，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室周漢華教授鑒定均符合有關(guān)規(guī)定。2.2感覺到中間產(chǎn)品的準備以上七味藥材，加水煎煮2次，每次1h，濾過，合并濾液，濃縮至700mL，即得。2.3蘭、木茉麗葉、鐵前奏的濃縮按照感清處方，分別制備藍布正、石吊蘭、木芙蓉葉、鐵筷子的陰性樣品，將濾液濃縮成稠膏(相對密度1.09)，置于烘箱內(nèi)60℃烘干，即得。3質(zhì)量控制3.1斷裂3.2性別標(biāo)記3.2.1氯甲烷-甲酸的色譜鑒別取藍布正對照藥材、藍布正陰性對照樣品、感清中間產(chǎn)品干燥后的粉末各1g，加50%乙醇20mL，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣以10mL水溶解，用三氯甲烷洗滌兩次，每次10mL。棄去三氯甲烷液，水層加乙酸乙酯振搖提取兩次，每次10mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加丙酮2mL使溶解，即得供試品。另取沒食子酸對照品，加丙酮制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。照《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB試驗，吸取上述4種溶液各2～3μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸(5∶5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置于日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。結(jié)果見圖1A。3.2.2石吊蘭對照藥材試驗取石吊蘭陰性對照樣品、感清中間產(chǎn)品干燥后的粉末各1g，加甲醇20mL，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，即得供試品溶液;另取石吊蘭對照藥材1g，加水20mL，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，即得石吊蘭對照藥材溶液;再取石吊蘭素對照品，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，作為對照品溶液。照《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB試驗，吸取上述4種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(20∶1∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。結(jié)果見圖1B。3.2.3供試品溶液及色譜檢出液取鐵筷子對照藥材、鐵筷子陰性對照樣品、感清中間產(chǎn)品干燥后的粉末各2g，加甲醇20mL，超聲處理20min，放冷，濾過，濾液低溫揮干約1mL，即得供試品溶液。照《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB試驗，吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯-甲酸(8∶2∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。結(jié)果見圖1C。3.2.4對照藥材的制備取木芙蓉葉陰性對照樣品、感清中間產(chǎn)品干燥后的粉末各1g，加乙醇10mL，稱定質(zhì)量，超聲提取1h，補足減失的質(zhì)量，濾過，濾液置水浴上蒸干，殘渣加甲醇0.5mL溶解，即得供試品溶液;另取木芙蓉葉對照藥材1g，加水10mL，稱定質(zhì)量，超聲提取1h，補足減失的質(zhì)量，濾過，濾液置水浴上蒸干，殘渣加甲醇0.5mL溶解，即得對照藥材溶液。另取金絲桃苷對照品適量，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液。照《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB試驗，吸取上述4種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)為展開劑飽和15min后展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇液，105℃加熱至斑點清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的黃色斑點。結(jié)果見圖1D。3.3相對密度的測量參照《中國藥典》2010年版一部附錄ⅦA項下比重瓶法測定，結(jié)果見表1。3.4蒸發(fā)宏觀測定精密量取樣品液25mL，置于已干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴上蒸干后，殘渣于105℃干燥3h，取出移至干燥器中，冷卻30min后稱定質(zhì)量，計算總固體量，結(jié)果見表1。3.5測量的測量3.5.1混合對照品溶液分別精密稱取沒食子酸和石吊蘭素對照品適量于100mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得每1mL含沒食子酸0.104mg和石吊蘭素0.0724mg的混合對照品溶液。精密稱取金絲桃苷照品適量于10mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得每1mL含金絲桃苷0.9860mg的對照品溶液。3.5.2微生物濾膜的制備精密量取50mL中間提取物于100mL量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，充分振搖，靜置，取適量上清液過0.45μm的微孔濾膜過濾，即得沒食子酸、石吊蘭素定量測定用供試品溶液。取感清中間產(chǎn)品粉末5g，精密稱定，加入50mL80%乙醇，稱定質(zhì)量，超聲提取0.5h，用80%乙醇補足減失的質(zhì)量，過濾，濾液揮干，用5mL甲醇溶解，過0.45μm的微孔濾膜，即得金絲桃苷定量測定的供試品溶液。3.5.3色譜條件及色譜柱沒食子酸、石吊蘭素:DiamonsilC18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);流動相甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脫，見表2;檢測波長280nm;體積流量為1mL/min;柱溫為30℃。金絲桃苷:色譜柱AlltimaTMC18(250mm×4.6mm,5μm);流動相乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫，見表2;檢測波長359nm;體積流量為1mL/min;柱溫為25℃。3.5.4線性關(guān)系研究3.5.4.標(biāo)準曲線的制備分別精密吸取沒食子酸對照品溶液(0.1221mg/mL)進樣2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20μL，注入高效液相色譜儀中，測定峰面積，以進樣質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)制備標(biāo)準曲線，得回歸方程:Y=3×106X-98075,r=0.99995，線性范圍:0.30525～2.44200μg。3.5.4.標(biāo)準曲線的制備分別精密吸取石吊蘭素對照品溶液進樣(0.0191mg/mL)2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5μL，注入高效液相色譜儀中，測定峰面積，以進樣質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準曲線，得回歸方程Y=4×106X+4840.9,r=1，線性范圍:0.04775～0.42975μg。3.5.4.標(biāo)準曲線的制備分別精密吸取金絲桃苷對照品溶液2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20μL，注入高效液相色譜儀中，測定峰面積，以進樣質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)制備標(biāo)準曲線，得回歸方程:Y=2×106X+60484,r=0.9998，線性范圍:0.2465～1.9720μg。3.5.5c.9.4單次給藥重復(fù)性試驗按3.5.2項下供試品的制備方法分別制備6份供試品，注入高效液相色譜儀測定，記錄峰面積，結(jié)果得C沒食子酸=0.2335mg/mL,C石吊蘭素=0.0727mg/mL,C金絲桃苷=0.0210mg/mL,RSD沒食子酸=1.16%,RSD石吊蘭素=1.06%,RSD金絲桃苷=1.78%，表明方法的重復(fù)性良好。3.5.6穩(wěn)定性試驗分別續(xù)用3.5.5項下的一份供試品，室溫放置，精密吸取10μL分別在0、2、4、6、8、10、12、24h依次進樣，測定峰面積，記錄色譜圖，得RSD沒食子酸=1.60%，RSD石吊蘭素=2.88%，RSD金絲桃苷=2.52%，表明方法穩(wěn)定性良好。3.5.7儀器精密度試驗續(xù)用3.5.5項下的一份供試品，精密吸取供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，重復(fù)進樣6次，記錄色譜圖，得RSD沒食子酸=0.98%，RSD石吊蘭素=1.06%，RSD金絲桃苷=2.46%，表明該儀器精密度良好。3.5.8加樣回收率試驗和對照品試驗取感清糖漿中間物6份，精密量取25mL，分別精密加入沒食子酸對照品(0.6319mg/mL)和石吊蘭素對照品(0.2028mg/mL)貯備溶液各10mL，用無水乙醇定容至100mL，注入高效液相色譜儀測定，記錄峰面積，計算出沒食子酸平均回收率為99.37%、RSD沒食子酸=2.05%，石吊蘭素的平均回收率為98.70%，RSD石吊蘭素=2.26%，表明該方法的回收率良好。結(jié)果見表3、4。精密稱取感清中間產(chǎn)品粉末0.25g，吸取質(zhì)量濃度為0.4mg/mL的金絲桃苷對照品溶液10mL，按3.5.2項下金絲桃苷供試品溶液的制備方法制備。注入液相色譜儀測定，記錄峰面積，計算出金絲桃苷平均回收率為98.52%、RSD金絲桃苷=2.93%，表明方法的回收率良好。結(jié)果見表5。3.5.9專業(yè)試驗3.5.9.陰性對照品溶液的制備取感清處方(不含藍布正)藥材量的1/2，照感清中間提取物的提取方法進行提取，按2.2項下供試品溶液的制備方法制備藍布正陰性對照品溶液。精密吸取供試品溶液10μL，注入液相色譜儀。與感清中間提取物對比，沒食子酸部位應(yīng)無峰。色譜圖見圖2E。3.5.9.陰性對照品溶液的制備取感清處方(不含石吊蘭)藥材量的1/2，照感清中間提取物的提取方法進行提取，按2.2項下供試品溶液的制備方法制備石吊蘭陰性對照品溶液。精密吸取供試品溶液10μL，注入液相色譜儀。與感清中間提取物對比，石吊蘭素部位應(yīng)無峰。色譜圖見圖2E。3.5.9.3木槿葉3.5.10樣品測定取樣品按2.1項下方法制備供試品溶液，進樣10μL，從所得色譜峰得出峰面積，代入回歸方程，即得。見表6。4中間提取物的初步篩選4.1金絲桃苷定量測定中流動相考察了乙腈-四氫呋喃-0.5%甲酸溶液，乙腈-0.1%冰乙酸溶液，甲醇-0.2%磷酸溶液(用三乙胺調(diào)pH)，乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫，甲醇-0.2%磷酸水，甲醇-0.1%磷酸水。甲醇分離效果很差，乙腈分離很好。金絲桃苷性質(zhì)不穩(wěn)定，在實驗中要避光冷藏。沒食子酸和石吊蘭素的實驗中考察了甲醇-0.4%磷酸水，甲醇-0.2%磷酸水梯度洗