難治性癲癇患者術后對淀粉樣蛋白表達的影響

ii類淀粉蛋白（i-app）是淀粉樣蛋白的代謝產物。根據最近的研究，i-app的過度表達可以促進軸突的擴張，促進其多向生長。軸突異常生長是異常生長和抗癲癇芽形成的重要分子基礎。因此，對抗癲癇藥物的研究對于闡明抗癲癇藥物的產生機制非常重要。我們聯合應用免疫組化和免疫熒光法檢測β-APP在耐藥性癲癇患者顳葉和海馬組織中的表達,并探討其在耐藥性癲癇芽生形成和神經網絡重建中的作用,現報道如下。1數據和方法1.1病例選擇及一般資料實驗組37例患者來自2004年12月～2006年7月在廣東省三九腦科醫院,第三軍醫大學新橋醫院和重慶醫科大學附屬第一醫院神外科進行手術治療的耐藥性顳葉癲癇患者。為了排除年齡老化因素對實驗結果的影響,實驗組的患者均為中青年且對照組與其年齡匹配。其中男性20例,女性16例,年齡14～56歲,平均30.5±12.98歲;病程3～46年,平均18.73±13.45年;其中復雜部分性發作7例,簡單部分性發作合并復雜部分性發作2例,復雜部分繼發全身強直-陣攣性發作例21,強直性發作2例、多種類型的發作4例(強直-陣攣性、強直性、陣攣性,復雜部分性)。共收集顳葉標本34例,海馬標本7例。對照組15例系在我院因意外死亡的患者,所有對照組患者符合下列條件:①無癲癇病史和家族史;②無顱內腫瘤、外傷或神經系統進行性疾病;③病理切片證實腦組織結構正常;④家屬同意,并簽署知情同意書;⑤收集腦組織標本時間在患者死亡后16小時內。其中男7例,女8例,年齡19～53歲,平均38.13±10.86歲,共獲顳葉15例,海馬5例。所有患者均符合以下條件:①符合吳遜、沈鼎烈難治性癲癇定義,經正規服用過三種或三種以上一線抗癲癇藥(苯妥英鈉、卡馬西平、丙戊酸、苯巴比妥),發作頻率沒有明顯減少;②無明顯病因可尋,神經系統體格檢查沒有局灶性神經系統體征或雖有體征但與癲癇發作無關;③頭顱CT或核磁共振檢查除海馬硬化外,沒有其他異常;④患者的發作類型符合國際抗癲癇聯盟1981年有關癲癇發作類型分類的規定;⑤術前定位及術中皮質電極監測發現有明確和固定的癲癇放電部位,有手術適應癥,且能進行手術者;⑥患者及其家屬術前簽注知情書。1.2實驗方法1.2.1樣本收集實驗組和對照組標本獲取后,置于4%多聚甲醛固定48小時,隨后常規石蠟包埋切片,常溫保存備用。術后標本同時送常規的病理檢查。1.2.2組織病理學觀察兩組石蠟標本用石蠟切片機行連續冠狀切片,片厚4～6μm,每個標本分別制備10張切片,排序,完成后,每個標本隨機抽取2張,行伊紅染色觀察耐藥癲癇腦組織的病理形態變化。1.2.3抗人抗體part石蠟切片常規脫水,抗原熱修復20min后0.3%催酮混合1%牛血清蛋白穿透1h,山羊血清封閉5h,加入一抗β-APP兔抗人抗體(SantaCruz,USA),滴度1∶100,室溫孵育16h,洗去一抗,加FITC標記的山羊抗兔抗體(北京中杉生物公司),室溫下孵育3h,洗去二抗,甘油混合PBS封片。激光共聚焦顯微鏡(LeicaMicrosystemsHeidelbergGmbH,Germany)行激光掃描圖像采集。實驗組及對照組每張切片上選取5個視野,測平均熒光強度值。1.3數據統計分析采用SPSS11.0統計軟件對實驗數據進行單因素方差分析(OneWayANOV),數據用平均數±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,兩組數據比較時若方差齊用t檢驗,方差不齊用t’檢驗,P<0.05為有顯著性差異。2結果2.1病理形態試驗結果HE染色顯示耐藥性顳葉癲癇腦組織和海馬中有不同程度的神經元丟失,變性,膠質細胞增生和軸突走向紊亂(圖1)。2.2-app陽性細胞激光共聚焦掃描結果顯示耐藥性癲癇顳葉和海馬組織內均可見大量綠色熒光著色的β-APP陽性細胞,在胞漿和軸突均有沉積,而對照組極少見陽性細胞(圖2)。免疫熒光強度值分析結果顯示β-APP在耐藥性癲癇腦組織中表達較對照組明顯增高且有統計學意義(表1)。3-app促進海馬神經網絡結構的改變盡管引起難治性癲癇的病因非常復雜,但苔蘚纖維芽生和神經元網絡重組仍然是難治性癲癇最為明顯的病理特征,神經元網絡重組可能通過改變癇樣放電的傳播方向和路徑,避開抗癲癇藥物作用的一些重要靶點,導致難治性癲癇的形成。但由于芽生形成和神經元網絡重組機制不清楚,無法對耐藥性顳葉癲癇作出早期診斷和進行有效治療,因此,研究與芽生機制密切相關的基因表達有利于揭示耐藥性癲癇形成機制,并為尋找新的治療途徑提供重要線索。β-APP是APP加工的正常產物,主要在中樞神經系統表達,正常成熟腦中僅有少量的β-APP表達。β-APP與細胞骨架蛋白之間存在著緊密的內在聯系,正常的β-APP對于神經系統發育中軸突的生長是必須的,細胞學實驗已經證實β-APP基因敲除后的海馬神經元顯示活力減少和神經軸突發育遲滯。但β-APP的表達異常增多卻可能導致軸突和神經網絡結構和功能改變,AD最具有特征性的病理改變即是β-APP常積聚引起的突觸結構破壞和神經元纖維纏結。而在腦損傷的患者中,β-APP的積聚和免疫陽性常作為一種標記物來判斷病人是否有軸突損傷。在動物實驗發現,NMDA注入海馬CA1區后,其興奮性毒性誘導CA1區和少部分皮層β-APP蛋白質表達和神經微絲的異常積聚是同時出現的,進一步提示β-APP與突觸功能改變存在某種內在聯系。為了排除年齡老化因素對實驗結果的影響,實驗組的患者均為中青年且對照組與其年齡匹配。我們的實驗發現在耐藥性顳葉癲癇患者的顳葉組織和海馬組織中,β-APP表達較對照組明顯上調。呈強陽性表達的β-APP不僅分布于神經細胞的胞漿,在軸索也可見大量β-APP陽性分布,提示β-APP可能通過發揮對軸索異常增生的作用參與耐藥性癲癇芽生和神經網絡重組。β-APP的作用機制很可能是通過影響tau蛋白等微管相關蛋白發揮其調節軸突生長作用的。我們的前期研究中發現磷酸化的tau蛋白在耐藥性癲癇患者腦組織中明顯增高,而動物實驗也發現急性癲癇模型中磷酸化Tau蛋白水平明顯增高,且其表達增高的時間和部位與苔蘚纖維出現的時間和部位一致,提示Tau蛋白參與了苔蘚纖維異常發芽的病理過程,在難治性癲癇的形成中起著重要作用,而β-APP是促進tau蛋白磷酸化的重要上游因子。β-APP25-35)通過激活Tau蛋白激酶1/3β糖原合成激酶(GSK-3β),至少使tau的5個磷酸化位點激活。β-APP還通過激活細胞周期蛋白依賴性激酶5(CDK5),絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK),促進細胞骨架蛋白磷酸化而這些神經細胞骨架蛋白異常與突觸重塑和神經網絡重建均有重要關聯,進一步提示β-APP可能是芽生和神經網絡重建的