糖尿病小鼠缺血誘導的血管新生障礙與胰島素治療的分子機制

糖尿病患者容易患心血管疾病，如心肌梗死、缺血性腦損傷和下肢動脈阻塞。缺氧的預后通常很差。其發病機制與糖尿病組織供血動脈阻塞后、反應性血管的再生和側支的形成有關。然而阻礙糖尿病患者缺血組織再血管化的具體機制目前尚不明了。新近研究報導,缺氧誘導因子1α(HIF-1α)介導的間充質衍生因子1α(SDF-1α)/血管內皮生長因子(VEGF)/蛋白激酶B(Akt)/內皮型一氧化氮合酶(eNOS)信號通路在組織缺血損傷后的內皮修復及血管新生過程中發揮重要作用。本研究利用糖尿病小鼠急性單側后肢缺血模型,觀察糖尿病動物是否存在缺血誘導的血管新生障礙,以及胰島素治療對這種障礙的影響,并探討其可能的分子機制。1材料和方法1.1各組患者30例C57BL/6小鼠(購自南京大學模式動物研究所)8周齡,隨機分為為非糖尿病組、糖尿病組和糖尿病胰島素治療組(胰島素組)3組,每組30例。參照文獻腹腔注射40mg/kg鏈脲霉素(Sigma公司)建立糖尿病模型。非糖尿病組腹腔注射等量檸檬酸鈉緩沖液。胰島素組參照文獻于手術前皮下注射10U/kgNovolinR(NovoNordisk公司)糾正高血糖,術后每日注射50U/kgLantus(Sanofi-Aventis公司)以維持血糖控制在11.1mmol/L以下,直至各時間點處死動物。1.2急性側下肢活檢人組小鼠飼養2個月后,參照文獻在立式顯微鏡下行左側股動脈及其大分支結扎離斷術,建立急性單側后肢缺血模型。通過紅四氮唑染色和后肢血管造影評估手術效果。1.3elisa法檢測vegf及sdf-1水平于術前及術后不同時間點(1、3、7及14天)采血,ELISA法檢測血漿VEGF及SDF-1α水平,操作按照檢測試劑盒(R&D公司)說明書進行。1.4羊毛密度計數于術前、術后7天及術后14天處死動物,游離雙側腓腸肌。參照文獻,CD31免疫組織化學染色法進行腓腸肌組織毛細血管密度計數。1.5小鼠vegf基因的構建參照文獻,免疫印跡法測定腓腸肌組織上述蛋白表達水平。組織勻漿沉淀用含蛋白酶抑制劑(Sigma-Aldrich公司)及磷酸酶抑制劑(Roche公司)的組織細胞裂解液提取細胞膜總蛋白,Bradford法定量。取100μg總蛋白變性后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,濕性電轉法將分離的蛋白轉移至PVDF膜上,轉移蛋白膜條以5%脫脂牛奶封閉后與一抗4℃過夜孵育[羊抗小鼠VEGF多克隆抗體1∶400(SantaCruz公司),兔抗小鼠Akt及磷酸化Akt(Ser473)單克隆抗體1∶2000(Eptomics公司),小鼠抗小鼠eNOS及磷酸化eNOS(Ser1177)單克隆抗體1∶500(BD公司),小鼠抗小鼠磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehydephosphatedehydrogenase,GAPDH)單克隆抗體1∶4000(CellSignaling公司)],孵育結束后以PBST充分洗滌,之后與相應的二抗室溫孵育2h。免疫反應結束后ECL法顯影,用QuantityOne圖象分析軟件分析目標條帶的光密度值,將待測蛋白條帶與同一泳道GAPDH條帶的光密度比值作為結果。1.6數據統計學處理應用SPASS11.0軟件進行統計學分析,所有數據均用xˉ±sxˉ±s表示,兩組均數間比較采用t檢驗,多組均數間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統計學意義。2結果2.1兩組平均血糖和體重比較入組時3組間小鼠體重和血糖差異無統計學意義。術后處死時,糖尿病組平均血糖約是非糖尿病組的3倍(P<0.01),而體重則較非糖尿病組降低約20%(P<0.01)。胰島素組血糖下降(P<0.01),接近正常,術后1周處死時體重較非治療糖尿病組有所增加(表1)。2.2紅四氮唑試驗左側股動脈及其大分支結扎離斷后因組織缺血線粒體損傷,紅四氮唑試驗不能產生有效染色反應而呈現白色(圖1)。后肢血管造影可見右股動脈及其大分支顯影清晰,而左側未見大血管及其分支顯影(圖1)。2.3大鼠血糖和投血量非糖尿病小鼠缺血側腓腸肌毛細血管密度在術后3天即較基線明顯增加,7天時增長速度達到高峰,14天后趨于平穩。術后7天時非糖尿病組缺血側腓腸肌毛細血管密度較非缺血側增加2.04倍(18.22±3.77比8.92±2.58,P<0.05),與術前比較差異有顯著性(P<0.01);糖尿病組缺血側腓腸肌毛細血管密度則無明顯變化(7.65±1.74比7.05±1.26,P>0.05),與非糖尿病組比較顯示其血管新生障礙(P<0.05);而胰島素組缺血肢體新生毛細血管密度增加1.90倍(15.36±2.14比8.07±1.96,P<0.05),與非治療糖尿病組比較差異有統計學意義(P<0.05;圖2和表2)。盡管術后14天時糖尿病組缺血后肢毛細血管密度較非缺血側增加1.52倍,但與非糖尿病組(2.43倍)及胰島素治療組(2.24倍)比較,其血管新生程度仍明顯降低(P<0.05,表2)。2.4血糖vegf及sdf-1水平缺血術后非糖尿病組血漿VEGF及SDF-1α水平均快速升高,在術后3天達到高峰(P<0.01),之后VEGF水平迅速回落,至術后7天時接近基線水平,SDF-1α則緩慢下降,持續兩周維持于較低水平。而糖尿病組缺血早期血漿VEGF及SDF-1α的釋放水平較非糖尿病組顯著減少(P<0.01)。胰島素治療明顯改善糖尿病缺血誘導的血漿VEGF及SDF-1α釋放受抑,術后3天時胰島素組血漿VEGF水平較糖尿病非治療組升高1.6倍(P<0.01),而SDF-1α水平亦有1.33倍升高(P<0.01),并在術后14天內持續高于糖尿病組水平,差異有統計學意義(P<0.01,圖3)。2.5各組小鼠腓腸肌vegf蛋白表達水平比較股動脈結扎離斷術后1周,3組小鼠非缺血側肌肉組織VEGF蛋白、Akt及eNOS磷酸化產物的表達很少,各組間比較差異無統計學意義。在缺血側,非糖尿病組腓腸肌組織VEGF蛋白表達明顯上調,并伴隨Akt及eNOS蛋白磷酸化增強;而糖尿病組缺血組織VEGF、磷酸化Akt及磷酸化eNOS的表達較非糖尿病組顯著減少(P<0.05)。胰島素治療有效增加糖尿病小鼠組織缺血誘導的VEGF蛋白表達水平,并增強Akt及eNOS蛋白磷酸化(P<0.05,圖4和表3)。3糖尿病狀態下血糖誘導vegf/akt信號通路活化的必要性本研究利用小劑量STZ連續腹腔注射法建立了實驗性糖尿病小鼠模型,通過股動脈結扎離斷術成功造成單側后肢急性嚴重缺血,并觀察到糖尿病動物缺血肢體的血管新生程度較非糖尿病組明顯減低,能夠模擬出臨床上糖尿病患者急性組織缺血后的血管新生障礙。本研究更為重要的發現是,組織缺血后非糖尿病小鼠血漿促血管生成因子SDF-1α及VEGF快速釋放,并伴隨著缺血組織VEGF蛋白表達增加、其下游信號分子Akt及eNOS磷酸化增強,而糖尿病組缺血誘導的血漿SDF-1α及VEGF上調顯著受抑,其靶組織VEGF/Akt/eNOS信號通路活化受損,這可能是阻礙糖尿病動物缺血后代償性血管新生的重要機制。缺血損傷發生后,損傷部位HIF-1α及SDF-1α生成增加。HIF-1α作為VEGF的轉錄活化因子,進一步上調缺血組織VEGF的表達與釋放。增多的VEGF與細胞表面受體結合后進而激活磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/Akt信號通路,活化的蛋白激酶Akt介導eNOS絲氨酸磷酸化,使eNOS酶活性增強,促進血管內皮合成與釋放NO。SDF-1α亦可通過PI3K/Akt/eNOS信號通路活化機制介導VEGF合成、Akt/eNOS磷酸化、NO釋放增加,進而增加局部血流、修復損傷內皮、誘導血管新生及側支形成。然而糖尿病狀態下生成增加的活性氧簇以及高血糖的直接毒性作用可導致HIF-1α表達減少、降解增加,繼而SDF-1α、VEGF釋放減少,其下游信號分子活化受抑,NO生物利用度降低,從而造成血管舒張功能障礙,內皮細胞凋亡加速、增殖與遷移受抑。隨著骨髓起源內皮祖細胞(endothelialprogenitorcell,EPC)的發現,人們逐漸認識到成體血管新生不僅依賴于原位血管成熟內皮細胞的芽生,循環中的EPC也積極參與各種生理及病理狀態下的血管新生以及損傷內皮的修復。現已明確,缺氧上調的SDF-1及VEGF促進骨髓EPC動員、歸巢至缺血組織或損傷血管,在缺血損傷部位,活化的SDF-1α/VEGF/Akt/eNOS通路信號分子誘導歸巢的EPC粘附分化、增殖存活、遷移并整合生成新生血管。而糖尿病患者及糖尿病動物缺血損傷后骨髓EPC動員障礙,同時EPC參與血管形成等功能存在嚴重缺陷。推測糖尿病狀態下缺血誘導的SDF-1α及VEGF信號通路活化受損可能是其功能障礙的關鍵因素之一。本研究進一步應用胰島素治療糾正高血糖,觀察糖尿病小鼠組織缺血后血管新生變化。實驗發現,胰島素治療可明顯增加缺血誘導的循環中SDF-1α及VEGF釋