2009屆碩士研究生論文答辯會研究生：祁學章導師：楊麗教授專業：神經病學塞來昔布對糖尿病大鼠缺血再灌注腦組織NF-κB和COX-2表達的影響

EffectsofcelecoxibontheexpressionofNF-κBandCOX-2indiabeticratswithfocalcerebralischemia-reperfusion

匯報內容一引言二材料與方法三結果四討論五結論六致謝

引言流行病學調查腦卒中是導致死亡的第二大類疾病，平均每15秒鐘就有一個腦卒中新發病例,每21秒就有一人死于腦卒中。每年死于腦卒中人數約150萬。缺血性腦卒中約占腦卒中總發病率的70%～80%發病率呈逐年上升趨勢多合并糖尿病、高血壓、高血脂等研究現狀神經系統炎癥因子腦缺血引起的炎癥反應

是以腦微血管中白細胞聚集并穿過血管壁、浸潤腦組織、同時伴有微血管功能紊亂及局部腦組織中液體及蛋白質積聚為標志的急性炎癥反應過程。其與腦缺血后的繼發腦損傷密切相關。其中,環氧合酶和核因子κB被認為是在神經系統的炎癥反應中發揮著樞紐性作用的關鍵因子。有關于環氧合酶一、環氧合酶的作用二、COX的亞型及作用COX-1誘導產生前列腺素發揮多種生理功能，如保護胃腸粘膜、支持腎臟中的微循環等COX-2正常情況下的表達腦缺血后腦組織中COX-2的表達核因子κB昔布類高選擇性環氧化酶-2抑制劑臨床應用方面對腦血管和神經方面的作用處于實驗階段塞來昔布不會導致缺血事件的增多。COX-2抑制劑所致的心血管缺血事件發生率是隨著每日劑量的增加和應用時間的延長而增加的。

研究的意義腦梗死患者合并糖尿病為臨床所常見，糖尿病不僅是腦梗死最常見的危險因素之一，且在腦梗死發作時可明顯加重腦損傷本研究用小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射SD大鼠，長期飼養，制作與人類相仿的慢性2型糖尿病模型，利用塞來昔布干預糖尿病大鼠腦缺血-再灌注模型，探索其作用機制，擬為臨床上的腦保護治療尋求理論依據。課題的創新之處首次檢測腦缺血再灌注的糖尿病大鼠的腦組織中用塞來昔布干預前后NF-κB和COX-2的表達變化情況，從而明確在缺血再灌注的糖尿病大鼠的腦組織中，它們三者之間的關系和意義

材料與方法實驗動物清潔級SD大鼠150只，體重180-200g，購自第三軍醫大學大坪醫院試驗動物中心許可證號：SCXK-2007017主要試劑Sigma

輝瑞公司

中杉金橋

中杉金橋

鏈脲佐菌素

西樂葆

NF-KBp65一抗

COX-2

一抗

主要儀器日本尼康光學顯微鏡微量電子天平電動恒溫水浴箱Leica細胞圖像分析儀實驗動物分組（200-220g大鼠）1.糖尿病大鼠假手術組（S組5只）2.dIR/NS組（NSIR組20只）3.dIR/Celecoxib低劑量組（LCIR組20只）4.dIR/Celecoxib高劑量組HCIR組20只）SSSNSLCIRHCIR各組分為術后6、12、24、48h四個亞組，每亞組5只分組圖示65只糖尿病大鼠

糖尿病動物模型制作

（1）高脂飼料喂養一月（2）大鼠的體重220-250g（3）鏈脲霉素（STZ）40mg/kg（4）血糖值標準13.5mmol/L

3腦缺血模型的制備麻醉大鼠分離組織結扎動脈插入栓線縫合創口恢復灌注給藥方法

不給藥缺血-再灌注后30分鐘后給予2ml生理鹽水灌胃一次，12h組大鼠在手術后8h再灌胃2ml生理鹽水一次,24h、48h組大鼠按每日2次灌胃，最后一次灌胃在取標本前4h

以塞來昔布15mg/kg和25mg/kg劑量制成混懸液約2ml灌胃,灌胃時間和NS組相同LCIR組、HCIR組NS組S組腦缺血模型評分標準0分：無神經系統癥狀與體征1分：出現同側Homer征，右側前爪不能完全2分：行走時向右側畫圈(追尾現象)3分：站立時向右側傾倒，不能行走或打滾4分:無自發活動，有意識障礙

1-3分為模型制備成功。

伸展標本的制備麻醉灌洗斷頭取腦以視交叉為中心、冠狀位±1.5mm切取腦片甲醛固定制作石蠟切片成模大鼠檢測免疫組化法檢測各組大鼠缺血側梗死灶周圍皮質中NF-κB和COX-2的動態表達

每張切片梗死灶周圍隨機取5個視野,結果取平均數不同視野可分辨的NF-κBp65和COX-2陽性細胞百分率

光學顯微鏡NIKONHY100日本尼康統計方法

方差分析統計學方法所測數據采用x±s表示

α=0.05結

果表1各組神經功能缺損評分(x±s,n=5)時間NS組LCIR組HCIR組6h2.20±0.452.00±0.711.80±0.4512h2.40±0.902.20±0.842.00±0.7124h2.60±0.55▲1.60±0.551.40±0.89﹟48h2.40±0.55▲1.40±0.551.20±0.44﹟注：▲與LCIR組、HCIR組相同時間點比較P<0.05﹟與LCIR組相同時間點比較P<0.05COX-2的表達腦組織COX-2表達6h組24h組12h組48h組

分組6h12h24h48hS組15.2±2.1——————NS組35.7±3.3▲＃54.5±4.3▲＃49.7±2.4▲＃

43.9±3.0▲＃

HCIR組27.8±2.5▲★40.9±2.9▲★

36.3±2.2▲★

33.0±1.8▲★

LCIR組30.3±3.2▲44.0±2.3▲

39.0±2.4▲

34.7±3.3▲

表1各組大鼠不同時間點腦組織COX-2表達陽性率（%）

▲與同一組內其它亞組比較，p＜0.05﹟與S組、HCIR組、LCIR組中相同時間點比較及與比較，p＜0.05★與LCIR組中相同時間點比較，p＞0.05表1各組大鼠不同時間點腦組織COX-2表達陽性率（%）

NF-kB的表達LCIR組NF-KB免疫組化染色（×400）6h組12h組24h組48h組表1各組大鼠不同時間點腦組織NF-kB表達陽性率（%）

6h12h24h48hS組18.3±3.2——————NS組45.3±2.4▲＃

70.5±5.1▲＃

59.7±5.5▲＃52.4±5.6▲＃HCIR組33.0±3.1▲＃52.4±4.8▲＃

43.7±3.8▲＃38.4±3.2▲＃

LCIR組35.1±2.6▲56.4±4.7▲45.7±3.8▲

40.4±3.2▲

▲與同一組內其它亞組比較，p＜0.05﹟與S組、HCIR組、LCIR組中相同時間點比較及與比較，p＜0.05★與LCIR組中相同時間點比較，p＞0.05表1各組大鼠不同時間點腦組織NF-KB表達陽性率（%）

NF-kB和COX-2表達趨勢圖討論COX-2炎癥中所致細胞毒性其機制

反應產物前列腺素的增加，增強腦內興奮性氨基酸的毒性作用和破壞性催化過程中生成的氧自由基的毒性作用加重腦缺血后的神經細胞的凋亡及增加NO的毒性效應本次試驗本實驗中發現COX-2在dIR組大鼠的各個時間點皆有表達，全腦均有散在表達，在梗死邊緣形態尚正常和已經有形態改變的神經元中表達最強烈，缺血中心區也見表達，以12h表達