SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）Sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis一.實驗目的

1.學習SDS測定蛋白質分子量的原理

2.掌握垂直板電泳的操作方法

二.實驗原理SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳:是在聚丙烯酰胺凝膠系統中引進SDS（十二烷基硫酸鈉）1967年，Shapiro等人首先發現，如果在聚丙烯酰胺凝膠電泳(聚丙烯酰胺凝膠中主要取決于三種因素：蛋白大小，形狀和電荷)系統中加入一定量的十二烷基硫酸鈉（SDS），則蛋白質分子的電泳遷移率主要取決于蛋白質的分子量大小？SDS的作用SDSisastrongdetergentagentusedtodenaturenativeproteinstounfolded,individualpolypeptides.Whenaproteinmixtureisheatedto100°CinpresenceofSDS,thedetergentwrapsaroundthepolypeptidebackbone.Itbindstopolypeptidesinaconstantweightratioof1.4gSDS/gofpolypeptide.Inthisprocess,theintrinsicchargesofpolypeptidesbecomesnegligiblewhencomparedtothenegativechargescontributedbySDS.Thuspolypeptidesaftertreatmentbecomerod-likestructurespossessingauniformchargedensity,thatissamenetnegativechargeperunitlength.Theelectrophoreticmobilitiesoftheseproteinswillbealinearfunctionofthelogarithmsoftheirmolecularweights.

當蛋白質的分子量在15,000－200,000之間時，樣品的遷移率與其分子量的對數呈線性關系。符合如下方程式：lgMW=－b

m+K

其中，MW為蛋白質的分子量，m相對遷移率，b為斜率，K為截距。當條件一定時，b與K均為常數因此通過已知分子量的蛋白與未知蛋白的比較，就可以得出未知蛋白的分子量SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)按照緩沖液的pH值和凝膠孔徑的差異及有無濃縮效應分為連續系統和不連續系統兩大類連續系統電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應不連續系統中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應，分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳Gel5%10%15%294566972002945669720029456697200Ammonium(AP)

(N2H8S2O8;MW:228.2).APSisasourceoffreeradicalsandisoftenusedasaninitiatorforgelformation.TEMED(N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine)(C6H16N2;MW:116.21).TEMEDstabilizesfreeradicalsandimprovespolymerization

垂直板電泳裝置加樣樣品遷移方向電泳過程中分子遷移的規律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒。混合樣品帶孔膠

按分子大小分離電泳方向

電泳

小分子大分子夾在兩塊玻璃板之間的凝膠

電泳緩沖液

電泳緩沖液

加在槽中的經SDS處理的樣品分子量小分子量大電源電泳后的凝膠徑考馬斯亮籃染色、脫色后的凝膠照片標準蛋白分子量未知蛋白在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對數與多肽鏈的相對遷移率成線性關系，所以可以通過標準曲線求未知多肽鏈分子量。

相對遷移率水平式電泳裝置電泳緩沖液凝膠操作過程1.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干

2.把玻璃板在灌膠支架上固定好(放好密封條和隔離板)

*固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板

分離膠(12%)濃縮膠(5%)ddH2O4.3ml2.37ml40%Acr3.0ml0.5mlBuffer1.5mol/LpH=8.8Tris-HCl2.5ml0.5mol/LpH=6.8Tris-HCl1.0ml10%SDS0.1ml40μl10%Ap0.1ml40μlTEMED4μl4μl

配膠3.按比例配好分離膠,用移液槍快速加入（或直接用小燒杯倒入）,大約5厘米左右,之后加少許蒸餾水（或異丙醇除泡）,靜置至膠凝

*凝膠配制過程要迅速,催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結無法注膠。注膠過程最好一次性完成,避免產生氣泡*水封的目的：保持分離膠上沿平直，排氣泡,加速聚合.

*膠凝好的標志：膠與水層之間形成清晰的界面

4.倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干,按比例配好濃縮膠,連續平穩加入濃縮膠至邊緣處,迅速插入梳子,靜置到膠凝

*梳子需一次平穩插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平

5.拔出樣梳后,拆掉密封條，在內槽中加入緩沖液*用吸瓶將加樣孔內和玻璃板下面放密封條位置的氣泡全部排出6.上樣：（1）marker10μl

（2）樣品（100℃沸水浴，3-5min處理并離心，蛋白變性）

7.微量注射器（加樣器）上樣,上樣量10-15μl

*微量注射器不可過低,以防刺破膠體；也不可過高,樣品下沉時易發生擴散，溢出加樣孔8.電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進行電泳，溴酚藍距凝膠邊緣約數cm時，停止電泳

9.凝膠板剝離與染色：電泳結束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標記后放在大培養皿內，加入考馬斯亮藍染色染色液，染色20-30min左右

10.脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數次，再用脫色液脫色，直到蛋白質區帶清晰

*剝膠時要小心,保持膠完好無損,染色要充分

11.實驗結果分析注意的問題

蛋白質電泳常用的SDS：單一亞基組成的蛋白質非變性PAGE：多個不同亞基組成的蛋白質

聚丙烯酰胺具有神經毒性，操作時要戴手套試劑1.40%丙烯酰胺（Acr）：2.10%SDS（十二烷基硫酸鈉）3.1.5mol/LpH8.8Tris-HCl緩沖液：稱取Tris18.2g，加入50ml水，用1mol/L鹽酸調pH8.8，最后用蒸餾水定容至100ml4.0.5mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液：稱取Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L鹽酸調pH6.8，最后用蒸餾水定容至100ml

（7）10%過硫酸銨(AP)

（8）TEMED（四甲基乙二胺）

（9）樣品溶解液：

SDS（100mg）+巰基乙醇（0.1ml）+溴酚藍（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/LpH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml。

（10）染色液：稱取考馬斯亮藍R2500.125g