廣西莪術揮發油氣相色譜-質譜聯用儀gc-ms指紋圖譜對藥效貢獻的研究

廣西莪術是2010年版《中國藥典》中收集的三種基原茂分術（curcumapha相應的生長和轉化）的一種，即c.k胡說八道。etc.f.liang和wenyunikc.wenyunik）中的一種。這是姜科江黃種植物的干燥生根。莪術的主要有效部位為根和根莖,揮發油是莪術的主要活性成分。文獻報道莪術油具有抗癌、抗凝血、抗氧化和保肝等作用,其中莪術醇、β-欖香烯、莪術酮、莪術二酮是莪術的主要抗腫瘤活性成分。目前對于莪術的質量評價多以化學成分為評價標準,沒有將化學成分組或者“有效組分群”與藥效結合起來,而中藥藥效物質基礎具有整體性、模糊性的特征,是有效物質群綜合效應結果。因此,本文在已發表的廣西莪術揮發油GC-MS指紋圖譜基礎上,通過體外實驗,研究莪術油對鼻咽癌細胞CNE-2的生長抑制作用,尋找與莪術抗腫瘤作用相關的“有效組分群”,尋找不同產地的廣西莪術揮發油與化學特征指紋峰之間的關系,以闡明廣西莪術抗腫瘤的藥效物質基礎。1材料表面1.1儀器、試驗裝置5973N-6890型氣相色譜-質譜聯用儀(美國Agilent公司),色譜柱HP-5MS毛細管柱(美國Agilent公司);FA1004型電子天平(海精科天平儀器廠),調溫加熱器(上海電理儀器廠),ThermoCO2孵箱(美國Thermoscientificcompany),Olympus倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司),激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司),Bio-TEK酶標儀(美國Bio公司),電泳槽(美國Bio-RAD公司),GENIUS凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)。1.2細胞培養基Hochest33342(凱基生物公司),四唑鹽(MTT)(美國Amresco公司)、二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司),細胞培養基PRMI1640(Gibco公司),胎牛血清(FBS)(杭州四季青公司),一抗及二抗(北京中衫金橋生物公司),其余均為國產分析純。CNE-2細胞株為本科學實驗中心傳代保株。1.3樣品采集和儲藏廣西莪術樣品分別于2007年1月采自靈山、貴港、橫縣3個主產區,其中靈山共采4批次、貴港和橫縣各采3批次,共計10個批次,樣品編號依次為1~10。樣品采收后洗凈、切片、曬干、打碎,過20目篩,干燥器儲藏備用。所有樣品經本教研室鑒定為姜科姜黃屬植物廣西莪術C.kwangsiensisS.G.LeeetC.F.Liang。2方法和結果2.1廣西桂術揮發油gc-ms指紋譜2.1.1掃描溫度lmHP-5MS毛細管柱(0.25μm×250μm×30.0m),載氣為高純氦氣,流速1.0mL·min-1,進樣量1μL,程序升溫:65℃恒溫2min,65~90℃(5℃·min-1)恒溫3min,90~103℃(20℃·min-1)恒溫3min,103~150℃(8℃·min-1)恒溫15min,150~280℃(20℃·min-1);不分流,進樣溫度250℃,進樣量1μL,倍增器電壓1435V,接口溫度280℃,離子源溫度230℃,電離方式EI;電子能量70.1eV;溶劑延遲3min,掃描質量范圍m/z45~550。在此色譜條件下,各特征能有效分離。2.1.2gc-ms指紋色譜根據2005年版《中國藥典》一部附錄XD法提取樣品揮發油和測定出油率,提取的10批次樣品揮發油分別用無水硫酸鈉除去水分,然后置于100mL量瓶中,加乙醚定容至刻度,0.45μm微孔濾膜過濾,即得。取各供試品溶液10μL,按上述色譜條件進行GC-MS分析,得到GC-MS指紋色譜圖(圖1)。圖譜經計算機譜檢索及人工解析研究其化學結構,比較10批樣品色譜圖后,從中選定20個共有峰指紋峰構成廣西莪術指紋圖譜的穩定特征峰,選擇14號峰β-欖香烯為內參峰(S峰),以其保留時間和峰面積為1,分別計算各特征峰的調整保留時間之比(α值)和相對峰面積(峰面積之比),結果見表1。2.2細胞內表達pmi-1330將提取干燥的10批次莪術油30mg,溶于3mL無水乙醇中,莪術油的初始質量濃度為10g·L-1。實驗中用含12%新生牛血清的RPMI-1640培養基將莪術油稀釋為100.0mg·L-1的濃度給藥,陰性對照組為10mL·L-1的無水乙醇培養基。取對數生長期的CNE-2細胞,接種于96孔板,細胞貼壁后加入藥物。于加藥后48h取出板,每孔加入20μLMTT溶液,4h后吸出上清液,加入150μLDMSO,震蕩10min,在酶標儀上于490nm處測定對照組及加藥組的吸光度(A),結果見表2。2.3關聯度分析根據文獻方法計算廣西莪術揮發油指紋圖譜特征與藥效作用之間的灰關聯度及關聯序。本研究將不同批次的廣西莪術揮發油對腫瘤細胞的增殖抑制率設為參考序列(母序列),比較數列(子序列)為20個特征峰,1~20號特征峰分別用x1~x20表示。將母序列與子序列進行灰色關聯度分析,依據關聯度的大小,確定了各特征成分對抗腫瘤作用貢獻的大小順序為:莪術醇>莪術二酮>β-欖香烯>吉馬酮>莪術酮>α-丁子香烯>δ-瑟林烯>β-石竹烯>β-欖香烯酮>a-蒎烯>α-石竹烯>桉油素>樟腦>2-壬醇>異龍腦莪術烯>δ-欖香烯>莰烯>D-檸檬烯>龍腦。結果表明廣西莪術抗腫瘤作用是其內“有效組分群”共同作用的結果,各特征峰代表的化學成分與其增殖抑制作用的關聯度雖大小不一,但都起了一定的作用。結果見表3。3指紋圖譜技術的應用指紋圖譜相似度評價方法是國家中醫藥管理局認可的用來判斷中藥化學成分相似性的一種方法。從理論上講,化學指紋圖譜相似度高的藥物,化學成分相似,其藥效也應該相似。但研究發現,10批次廣西莪術揮發油的指紋圖譜用相似度評價軟件評價后,在主要特征峰不一致時,仍具有很高的相似度。如在橫縣主產區的2個批次的樣品中均未檢測到莪術醇,但GC-MS相似度均達到了0.99以上。抗腫瘤藥效學研究結果發現,不含莪術醇的上述2個批次樣品對腫瘤增殖的抑制作用較低,抑制率僅為8.88%和8.49%。來自貴港的6個批次樣品莪術醇含量最高,而其對腫瘤增殖的抑制作用大,抑制率98.57%。由此可以看出,不能僅以指紋圖譜相似度評價的方法來推測藥效。灰關聯度分析作為對模糊系統研究的有效手段,已被廣泛應用于經濟評價、投資決策、環境檢測、人員考核、項目評估以及機械加工等過程控制與質量評價中。大量的研究已證實,上述各領域的研究共同特點是系統的信息量較少,而涉及的因素多,而且這些因素往往是相互影響、相互作者,并非獨立的。目前灰關聯度分析應用于對中藥材的質量評價研究較少,但其具有既包含有已知信息,又包含有未知信息的特點,通過對其研究可利用已知的信息,去揭示未知的信息,因此更適于含有復化學成分的中藥材的質量評價和控制。基于此,本研究通過尋找“有效組分群”的指紋特征與抗腫瘤活性效應之間的聯系來開展研究,在廣西莪術揮發油GC-MS指紋圖譜和藥學效研究的基礎上,獲得了廣西莪術揮發油GC-MS指紋圖譜20個特征峰面積與對鼻咽癌細胞的增殖抑制作用的量化數據,采用灰關聯度分析技術,以相對關聯