1/1《培養基的制備與消毒滅菌》實驗報告《培育基的制備與消毒滅菌》試驗報告

試驗目的

1.學習和把握配制培育基（以牛肉膏蛋白胨培育基的配制為例）的一般方法和原理。

2.了解消毒和滅菌的原理，把握常用滅菌方法的操作步驟。

試驗原理

培育基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產物的養分基質，用以培育、分別、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產物。在自然界中．微生物種類繁多，養分類型多樣，加之試驗和討論的目的不同，所以培育基的種類許多。但是，不同種類的培育基中，一般應含有水分、碳源、氮源、能源、無機鹽、生長因素等。不同微生物對PH要求不一樣．雷菌和酵母的培育基的pH一般是偏酸性的，而細菌和放線菌的培育基的pH一般為中性或微堿性的(嗜堿細菌和嗜酸細菌例外)。所以配制培育基時，都要依據不同微生物的要求將培育基的pH調到合適的范圍。此外，由于配制培育的各類養分物質和容器等含有各種微生物，因此，已配制好的培育基必需馬上滅菌．假如來不及滅菌，應暫存冰箱內，以防止其中的微生物生長繁殖而消耗養分和轉變培育的酸堿度所帶來不利的影響。

高壓蒸氣滅菌是將持滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋套間的水沸騰而產生蒸氣。待水蒸氣急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉排氣閥．連續加熱，此時由于蒸氣不能道出，而增加了滅菌器內的壓力，從而使沸點增高，得到高于100℃的溫度。導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。

牛肉膏蛋白胨培育基是一種應用最廣泛和最一般的細菌基礎培育基，有時又稱為一般培育基。由于這種培育基中含有一般細菌生長繁殖所需要的最基本的養分物質，所以可供作微生物生長繁殖之用?；A培育基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏為微生物供應碳源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要供應氮源和維生素，而NaCl供應無機鹽。在配制固體培育基時還要加入肯定量瓊脂作凝固劑，瓊脂在常用濃度下96℃時溶化，實際應用時，一般在沸水浴中或下而墊以石棉網煮沸溶化，以免瓊脂燒焦。瓊脂在40℃時凝固，通常不被微生物分解利用。固體培育基中瓊脂的含量依據瓊脂的質量和氣溫的不同而有所不同。

由于這種培育基多用于培育細菌，因此要用稀酸或稀堿將其PH調至中性或微堿性，以利于細菌的生長繁殖。

牛肉膏蛋白胨培育基的配方如下：

牛肉膏3.0g

蛋白胨10.0g

NaCl5.0g

水1000ml

pH7.4—7.6

試驗儀器與藥品

1.溶液或試劑：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、1mol／LNaOH、1mol／LHCl。

2.儀器或其他用具：試管、三角瓶、1000ml燒杯（或1000ml刻度搪瓷杯）、量筒、玻棒、培育基分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙（pH5.5-9.0）、一般棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布等。

試驗步驟

（一）牛肉膏蛋白胨培育基的制備

1.稱量（假定配制1000ml培育基）

按培育基配方比例依次精確?????地稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入燒杯（或1000ml刻度搪瓷杯）中．牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。也可放在稱量紙上，稱量后直接放人水中，這時如略微加熱，牛肉膏便會與稱量紙分別，然后馬上取出紙片。

2.溶化

在上述燒杯中先加入少于所需要的水量（如約700ml），用玻棒攪勻，然后，在石棉網上加熱使其溶解，將藥品完全溶解后，補充水到所需的總體積（1000ml）；假如配制固體培育基時，將稱好的瓊脂放人已溶的藥品中，再加熱溶化，最終補足所損失的水分。

3.調pH

在未調pH前，先用精密pH試紙測量培育基的原始pH，假如偏酸．用滴管向培育基中逐滴加入1mol／LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其PH，直至pH達7.4-7.6。反之，用1mol／LHCl進行調整。

4.過濾

趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利某些試驗結果的觀看。可以省去(本試驗勿需過濾)。

5.分裝

液體分裝

分裝高度以試管高度的1／4左右為宜。分裝三角瓶的雖則依據需要而定，一般以不超過三角瓶容積的一半為宜，假如是用于振蕩培育用，則依據通氣量的要求酌情削減；有的液體培育基在滅菌后，需要補加肯定量的其他無菌成分，如抗生素等，則裝量肯定要精確?????。

固體分裝

分裝試管，其裝量不超過管高的1／5，滅菌后制成斜面。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。

半固體分裝

一般以試管高度的1／3為宜，滅菌后垂直待凝。

6.加塞

培育基分裝完畢后，在試管口或三角瓶口上塞上棉塞(或硅膠塞、金屬或高溫塑料試管帽等)，以阻擋外界微生物進入培育基內面造成污染，并保證有良好的通氣性能(棉塞制作方法附本試驗后面)。

7.包扎

加塞后，將全部試管放入鐵絲筐或用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培育基名稱、配制日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結形式扎好，使用時簡單解開，同樣用記號筆注明培育基名稱、配制日期。

8.滅菌

將上述培育基以0.103MPa，l21℃，20min高壓蒸氣滅菌。

9.擺斜面

將滅菌的試管培育基冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，將試管口端擱在玻棒或其他合適高度的器具上，擱置的斜面長度以不超過試管總長的一半為宜

l0.無菌檢查

將滅菌培育基放入37℃的恒溫箱中培育24-48h．以撿查滅菌是否徹底。

留意事項

1.蛋白胨很簡單吸濕，在稱取時動作要快速，另外，稱量時嚴防藥品混雜．一把牛角匙用于一種藥品．或稱取一種藥品后，洗凈——擦干——再稱職另一藥品——瓶蓋也不要蓋錯。

2.在瓊脂溶化過程中．應掌握火力，以免培育基因沸騰而溢出容器。同時，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦，制培育基時，不行用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進入培育基中，影響細菌生長。

3.對于有些要求PH較精確的微生物，其PH的調整可用酸度計進行(使用方法、可參考有關說明書)。pH不要調過頭，以避開回調而影響培育基內各離子的濃度。配制pH低的瓊脂培育基時．若預先記好PH并在高壓蒸汽下滅菌，則瓊脂因水解不能凝固。因此，應將培育基的成分和瓊脂分開滅菌后再混合，或在中性pH條件下滅菌，再調整pH。

4.分裝過程中，留意不要使培育基沾在管(瓶)口上，以免沾污面塞而引起污染。

（二）高壓蒸汽滅菌法步驟

1.加水

使用前在鍋內加入適量的水，加水不行過少，以防將滅菌鍋燒干，引起炸裂事故。加水過多有可能引起滅菌物積水。水面與三角架相平為宜

2.裝料

將滅菌物品放在滅菌桶中，不要裝得過滿。

3.加蓋

蓋好鍋蓋，按對稱方法旋緊四周固定螺旋，打開排氣閥。

4.加熱排氣

加熱后水蒸氣與空氣一起從排氣孔排出，待鍋內沸騰并有大量蒸汽自排氣閥冒出時，排出的氣流很強并有噓聲時，維持2—3min以排解冷空氣。如滅菌物品較大或不易透氣，應適當延長排氣時間，務必使空氣充分排解，然后將排氣閥關閉。

5.加壓

將排氣閥關閉

6.保壓

當壓力升至0.1MPa時，溫度達121℃，此時應留意觀看，掌握熱源。保持壓力穩定，維持20-30min后，切斷熱源。

7.自然降壓

當壓力表降至“0”處，稍停，使溫度連續降至100℃以下后，打開排氣閥，旋開固定螺旋，開蓋，取出滅菌物。留意：切勿在鍋內壓力尚在“0”點以上，溫度也在100℃以上時開啟排氣閥，否則會因壓力突然降低，而造成培育基猛烈沸騰沖出管口或瓶口，污染棉塞，以后培育時引起雜菌污染。壓力降到“0”時，方可打開排氣閥。

8.保養

滅菌完畢取出物品后，將鍋內余水倒出，以保持內壁及內膽干燥，蓋好鍋蓋。

9.培育基無菌檢查五、關鍵步驟及留意事項

1.要嚴格按配方配制。

2.調pH不要過頭。

3.干熱滅菌要留意物品不要堆放過緊，留意溫度的時間掌握，70?C以下放物、取物。

4.高壓滅菌要留意物品不要過多，加熱后排解冷空氣，到時降壓回零取物。

5.過濾除菌要留意