熒光檢測在醫學試驗中的應用–復習題第一章總論熒光的發生及基本檢測原理1何謂發光？分子吸取輻射被激發后以光的形式釋放，輻射躍遷而衰變回到電子基態→發光2熒光與磷光的區別？熒光：激發后立即發光，第一電子激發單重態輻射躍遷；延遲10-9～10-7秒后。基態S0→單重態S1、S2躍遷→基態。磷光：延遲時間長，幾毫秒或更長10-3～10秒電子自旋未配對進入受激三重態，三重態→躍遷→基態3完畢良好熒光檢測的有關條件？1）選擇對應的激發波長2）選擇足夠強度的激發光源，熒光強度與入射光強度成正比If＝φfI0(1-It/I0)；3）選擇合適(QE)的發射波長檢測器件；4）控制好樣品制備與檢測環境體系。4熒光的種類根據激發方式。1）光化發光2）化學熒光3）生物熒光。按熒光素的標識過程可分為：1）免疫熒光2）組織熒光3）誘導熒光5有哪幾種熒光現象？I次熒光現象：固有或自發熒光；一經輻射就可發出熒光的物質。II次熒光現象及熒光色素(標識物)又稱繼發熒光；樣品分子不能或只能發出很弱的熒光，對此類分子需先經熒光色素標識結合或插入到不發光的大分子中去，根據熒光探針的熒光分析大分子。6影響熒光強度（If）的原因1光化分解：熒光物質吸取光能后，某些鍵斷裂，導致熒光弱。制片時應避光。2熒光淬滅：（1）溫度淬滅：加緊震動弛豫而喪失振動能量；增長分子熱運動高溫熒光分子與液基環境中分子碰撞。溫度合適或低溫。（2）濃度淬滅：濃度大時發光分子在樣品中分布不均，深部的分子吸取不到光子，量子產額反而小。生成二聚體或多聚體，變化吸取光譜，If減少。（3）雜質淬滅：靜態淬滅，雜質與熒光分子構成另一種化合物。環境凈化。碰撞、轉入三重態淬滅。3pH影響：破壞熒光物質環鏈構造，芳香族化合物的酸、堿功能團對pH敏感。7半波寬定義：最大透光度Tmax波長1/2處對應的兩波長差(λ1-λ2)也稱帶寬(Bandwidth),帶寬窄則光色純。第二章熒光成像檢測1光學顯微鏡辨別率定義及簡易計算公式2影響光學顯微鏡辨別率的重要原因？影響辨別率的原由于衍射效應：圓斑像AIRY斑，阻礙辨別率。3聚光鏡與物鏡孔徑光闌的對應調整？目的：產生與物鏡對應的光束，使鏡像的反差和焦深處在最佳狀態。不一樣倍率物鏡有不一樣的NA值，改換物鏡聚光鏡NA應做對應調整。觀測：與物鏡NA一致(100%)，以得到很好的辨別率；照像：相稱于物鏡NA的60~80%,以得到很好的反差、焦深。4光學顯微鏡的有效放大＝所用物鏡NA值的500～1000倍5熒光量子效率（QE）熒光量子效(產)率=放射量子數／吸取量子數6醫學試驗中熒光檢測常用的熒光檢測傳感器是哪兩種？1轉換光學信號為電子信號-光學傳感器,2彩色CCD7顯微鏡攝影術的定義?將顯微鏡視場中的微觀圖像記錄為放大圖像的技術8影響CCD成像效果的重要原因是什么?溫度和敏捷度，CCD工作時，表面會產生熱量，使得在芯片形成暗電流，暗流將增長噪音、減少信噪比、導致減少成像質量。9CCD成像放大倍率的計算公式顯示或照片倍率＝OBJ倍率×光學適配器倍率×顯示或照片對角線長度／CCD對角線長度10熒光顯微鏡CCD成像與激光共焦顯微鏡成像的比較數字CCD長處：價低，使用簡便，成像塊，測得FI同LSCM，彩色還原好，圖像近于鏡下，光化淬滅傷害小。Ratio測鈣、使用TC板，適于標本：薄、層次簡樸。缺陷：厚標本圖像質量差，無光切功能，整合功能配置價格不菲激光共焦掃描顯微鏡，長處：辨別率高，光切片，3D空間立體構造觀測，集成熒光分析功能。缺陷：成本高（專人、耗材），光化淬滅傷害較大11免疫熒光染色的目的將抗體標識上熒光素（如FITC、TRITC），與細胞內對應抗原（目的蛋白）結合后，通過觀測、檢測具有特性性的熒光，定性、定位及定量的顯示和檢測細胞內目的蛋白12.免疫熒光染色常用措施直接法、間接法和雙標識法13.影響免疫熒光染色成果的重要原因有1）熒光染料標識的抗體的濃度，2）溶液的pH值，3）溶劑14.舉例闡明自發熒光重要包括哪些動物中一般為黃素類和卟啉類，植物中為葉綠素輕易產生自發熒光。脂褐素的自發熒光，彈力蛋白和膠原UV激發下呈黃綠色熒光，培養死細胞很輕易產生自發熒光。15.免疫熒光染色前對細胞接種密度的規定細胞密度：根據試驗目的調整細胞接種密度。對細胞個體進行形態學觀測以及定位熒光信號：細胞密度稍稀疏。使細胞充足伸展，顯示出其應有的形態和構造；但也要注意保證視野內有一定數目的細胞，以便選用有代表性的細胞采圖，規定細胞所占面積不低于視野的20%。定量測定熒光強度（觀測某種蛋白的體現量）：細胞密度應稍高。用于做大量細胞的記錄定量，細胞至少要占到視野面積的80%；這時細胞要充斥視野但互相之間尚有空隙，細胞排列均勻，不聚堆擁擠，防止細胞間擠壓變形，影響定量成果。到達一般所說的亞融合狀態。16熒光顯微鏡觀測免疫熒光染色需要設置的對照及意義對的設置對照組（非常必要）：1.陽性對照：已知抗原陽性的樣品與待測樣品同步進行免疫熒光染色，對照樣品呈陽性成果，用于檢查免疫熒光染色全過程與否符合規定，包括孵育溫度、時間，一抗、二抗與否有問題，分析也許原因。假如陽性對照呈陰性，則闡明試驗過程有問題，需要對每個條件加以分析改善。2.陰性對照：已知抗原陰性的樣品作對照，對照樣品應呈陰性成果。包括空白對照（PBS替代一抗）和替代對照（非免疫血清替代一抗），用于排除非特異性染色。假如陰性對照呈陽性體現，同樣檢測樣品的成果也是不可信的。3.不染色細胞空白組：不經免疫熒光染色，直接上機觀測，用于檢測由于細胞自身或固定導致的細胞自發熒光。17共聚焦掃描顯微鏡（LCSM）光學成像原理檢測針孔和光源針孔一直聚焦于同一點，使聚焦平面以外被激發的熒光不能進入檢測針孔--高辨別率的光學切片18共聚焦掃描顯微鏡(LSCM)與老式熒光顯微鏡比較的長處1）提高了敏感性及辨別率，2）擴大獲取信息范圍，3）實現了圖像三維重建，4）客觀記錄熒光信息，5）同步顯示多種標識物19.定義：熒光漂白恢復(FRAP)：經熒光探針標識的細胞的某一區域一旦被高強度的激光照射后,熒光物質的光化學構造被破壞,熒光強度下降,但此處熒光強度會漸漸恢復,熒光強度和恢復的快慢和多少,代表周圍分子擴散的速率,或分子運動速度。20.定義：熒光共振能量轉移(FRET)：受激態熒光素將其能量向另一種熒光素傳遞，使后者被激發，這一過程稱熒光能量共振轉移。能量的提供者叫供體熒光素，能量的接受者叫受體熒光素。第三章熒光光度檢測1熒光分光光度計的構造示意圖光源→激發單色器→樣品杯→發射單色器→檢測器→電子放大及控制→顯示2微孔板熒光檢測在醫學試驗的應用1）運用匯報基因檢測目的基因的體現：將匯報基因引入細胞DNA使之與某一特定分子事件有關，可認為這一分子事件帶來可測性。一般檢測的分子事件是基因功能，具有可測性的是發光。目前，市場上有許多發光匯報基因發售。包括：螢火蟲熒光素酶（fireflyluciferase），β－半乳糖苷酶（B-galactosidase）等。2）ATP水平測定：所有活細胞都具有ATP。ATP可以從細胞中提取出來，用螢火蟲熒光素酶檢測。熒光強度與樣品中ATP的含量成比例，對應的與提取ATP所用的細胞數成比例。可以檢測樣品中的所有微生物，因而被用于檢測水中的大腸桿菌含量，用于藥物，化妝品，牛奶以及其他食品的微生物控制，測定土壤和沉積物中的所有活生物含量，評價抗生素對微生物生長的影響，理解不一樣藥物對哺乳動物細胞的影響等。3）離子測定：如細胞內鈣離子測定。3活細胞內鈣離子濃度測定的措施即從測量出的熒光信號中定量地計算出鈣離子濃度。對于單波長激發或發射的熒光指示劑，可按下式計算[Ca2+]=Kd(F一Fmin)/(Fmax一F)，Kd：熒光劑與Ca2+形成配合物的解離常數，Fmin和Fmax為最小熒光強度和最大熒光強度。對于雙波長的熒光指示劑，用率比值信號來計算細胞內游離Ca2+濃度，用下式計算細胞內游離Ca2+濃度，[Ca2+]=Kd(Fd/Fs)(R一Rmin)/(Rmax一R)Kd：熒光劑與Ca2+形成配合物的解離常數.Fd和Fs分別表達熒光劑沒有結合Ca2+和被Ca2+飽和時的熒光強度.，R為試驗觀測到的熒光比值.Rmin為細胞內熒光劑最小量結合Ca2+時的熒光比值.，Rmax為胞內熒光劑被Ca2+飽和時的熒光比值.4fura2指示劑測鈣原理Fura2:由紫外激發的一種率測量指示劑，因有較強的親水性，難以進入細胞，在其負性基團部位結合上親脂的乙酰羥甲基酯成為Fura-2/AM后，與細胞溫孵時很輕易透過細胞膜，胞漿內的酯酶可將Fura-2/AM水解成Fura-2而滯留在胞漿內，后者與胞內游離的鈣離子結合形成Fura-2-鈣離子復合物。當Fura-2與Ca2+結合后吸取峰發生變化，在最大和最小Ca2+濃度時,它的最大吸取峰分別在335nm和363nm處，在作率測量時，常常選用的波長是340nm和380nm；結合鈣和游離鈣形式Fura2的發射峰都是510nm，其發射光的強度與鈣離子的濃度呈比例關系第四章熒光細胞激活分選、分析1簡述流式細胞儀的工作原理流式細胞儀的工作原理：將待測標本制備成單細胞懸液,經熒光染色后由氣壓裝置送入流動室,流動室由樣品管和鞘液管構成,鞘液管充斥流動的鞘液,鞘液流與樣品流壓力不等,當兩者壓力差到達一定程度時,鞘液裹挾著樣品流迫使細胞有序地排列成單列,逐一進入激光聚焦區。經激光束激發,產生散射光和熒光信號。通過某些波長選擇通透性濾光片,即可將不一樣波長的散射光和熒光信號辨別開來。散射光和熒光信號接受后轉換成數字信號送計算機處理,可在計算機上直觀地記錄染上多種熒光染料的細胞各自的百分率。2簡述流式細胞儀的構造1）流動室及液流驅動系統2）激光光源及光束成形系統3）光學系統4）信號檢測與存貯、顯示、分析系統5）細胞分選系統3前向角散射定義(FSC，ForwardScatter)前向角散射(FSC，ForwardScatter)：0°散射,與被測細胞的大小和面積有關，確切說與細胞直徑的平方親密有關，一般在FCM應用中，選用FSC作閾值，來排除樣品中的多種碎片及鞘液中的小顆粒，以防止對被測細胞干擾。4側向角散射定義(SSC，SideScatter)側向角散射(SSC，SideScatter)：90°散射,對細胞膜、胞質、核膜的折射率更為敏感，可提供有關細胞內精細構造和顆粒性質的信息。5試述AnnexinV/PI染色應用流式細胞儀檢測細胞凋亡的基本原理基本原理：細胞凋亡初期變化發生在細胞膜表面，這些細胞膜表面的變化之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜內轉移到細胞膜外，使PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常重要存在于細胞膜的內面，在細胞發生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。AnnexinV是一種Ca2+依賴的磷脂結合蛋白,具有易于結合到磷脂類如PS的特性,對PS有高度的親和性。該蛋白可充當敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。6簡述PI（碘化丙啶）染色時出現細胞凋亡峰的原理在凋亡細胞內，由于細胞核的解聚和凋亡小體的形成，核內的總DNA含量下降。由于在凋亡細胞內DNA含量下降，在G1峰前出現亞二倍體峰，稱亞G1期峰，又稱凋亡細胞峰。7試述PI（碘化丙啶）染色應用流式細胞儀檢測細胞周期的原理碘化丙啶是一種雙鏈DNA的熒光染料，可以和DNA結合，通過流式細胞術檢測到的與DNA結合的PI的熒光強度直接反應了細胞內DNA含量的多少。由于細胞周期各時相的DNA含量不一樣,一般正常細胞的G1／G0期具有二倍體細胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍體細胞的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。因此,通過流式細胞術PI染色法對細胞內DNA含量進行檢測時,可以將細胞周期各時相辨別為G1／G0期,S期和G2/M期,并可通過特殊軟件計算各時相的百分率。8流式細胞儀的細胞分選原理流式細胞儀的分選功能是通過流束形成具有細胞的帶電液滴而實現的。在流動室的噴嘴上裝有一種超聲振蕩壓電晶體片,該裝置在充電后以每秒上萬次的振動頻率,使液束成為上萬個液滴，待測細胞分散在這些液滴中。此時,細胞的熒光和散射光信號已被測量,經邏輯判斷，給流束一種充電脈沖信號,小水滴就所有帶上了正負不一樣的電荷，當液滴流經帶有幾千伏的偏轉板時，在高壓電場的作用下偏轉，落入各自的搜集容器中。9與其他分選措施相比流式細胞分選的特點1）少許細胞分選時，流式細胞分選精度高，速度快。先進的流式分選速度可達25000個細胞/秒以上；一次分離的最大合理量為108次方個細胞。2）可以同步進行多種Marker分選，正選負選同步進行，也可以進行4路分選。3）不僅僅限于表面標識物，流式細胞儀可以根據任何能檢測到的散射光（如細胞體積）或熒光（如DNA,?RNA或蛋白含量，酶活性，特異抗原）強度差異來分離細胞。4）假如只是偶爾做幾次細胞分選的話，用流式細胞分選還是比較劃算，只需準備樣品和抗體，交納一定的儀器使用費用即可，不需要購置配套的設備。10同型對照同型對照是使用與一抗相似種屬來源、相似亞型、相似劑量和相似的免疫球