基因芯片技術(shù)朱麗雅０６／１１／１３生物芯片(Biochip)技術(shù)

通過加工工藝同時將大量的探針分子固定到固相支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息并進行高效的解讀和分析．１.基因芯片２.蛋白質(zhì)芯片３.芯片實驗室命名：“GeneChip”——Affymetrix率先專利注冊

Microarray，DNA微陣列——通用地位80年代——克隆，90年代——PCR；21世紀(jì)——芯片

Microarray——近10年來生命科學(xué)研究領(lǐng)域中的最高效技術(shù)之一優(yōu)點傳統(tǒng)：Northern雜交、RT-PCR和核酶保護性分析等——只針對單個基因來分析Microarray：高通量模式研究效率——提高成千上萬倍研究層面——總體全局的基因之間相互關(guān)系廣泛應(yīng)用——基礎(chǔ)研究方面如基因表達水平的檢測、基因間相互作用模式、基因診斷、測序；產(chǎn)業(yè)化方面也有藥物篩選、藥物基因組圖譜、個性化治療、中藥物種鑒定、農(nóng)作物的優(yōu)育優(yōu)選、司法鑒定、食品衛(wèi)生監(jiān)督等許多領(lǐng)域。基本工作流程以AffymetrixGeneChip為例．

樣品制備標(biāo)記雜交數(shù)據(jù)獲取和分析樣品制備樣品

DNA樣品RNA樣品——先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA

樣品核酸的拷貝數(shù)提高達到檢測的靈敏度樣品或后續(xù)測試信號適當(dāng)?shù)姆糯髽悠窋U增

同時對樣品核酸分子大量的區(qū)域進行擴增e.g.PCR

去除了多余的RNA（rRNA占約80%）,RNA污染增加非特異性擴增標(biāo)記方法標(biāo)記引物標(biāo)記三磷酸脫氧核糖核苷酸標(biāo)記物：

熒光分子直接標(biāo)記生物素間標(biāo)——放大信號

熒光標(biāo)記:單色標(biāo)記——以減少流程或者芯片制作過程中所造成的控制性差異，確保實驗的可靠性和可重復(fù)性。雙色標(biāo)記——用不同顏色熒光素標(biāo)記兩個引物雜交反應(yīng)（關(guān)鍵）通過選擇合適的反應(yīng)條件使生物分子間反應(yīng)處于最佳狀況中，減少生物分子之間的錯配比率，從而獲取最能反映生物本質(zhì)的信號。dsDNA芯片單鏈DNA（寡核苷酸）芯片——有助于防止雙鏈DNA在雜交時產(chǎn)生干擾，而且芯片上各點寡核苷酸長度相對一致，使得雜交條件較為一致，有助于減少由于雙鏈DNA長度差別導(dǎo)致雜交條件差異的問題。

按載體上所點探針的長度分為：

(1)cDNA芯片:由Schena建立,將特定的cDNA經(jīng)PCR擴增后借助機械手直接點到基片上。(2)寡核苷酸芯片:由Fodor首先報道,用照相平板印刷術(shù)和固相合成技術(shù)在基片上生成寡核苷酸,分為長寡核苷酸芯片和短寡核苷酸芯片,與cDNA芯片制作的一個主要不同點是多一步轉(zhuǎn)錄獲得cRNA的過程。起初,人們認(rèn)為長寡核苷酸芯片和cDNA芯片有更高的特異性和靈敏度。但短寡核苷酸芯片同樣有效和特異。信號檢測

芯片上點的高集成度要求高靈敏度的檢測設(shè)備。雙色標(biāo)記為例：１.芯片掃描儀采集各反應(yīng)點的熒光強弱和熒光位置２.對每一種染料掃描一定的軟件處理并合并得到每個點的重疊圖

３.點數(shù)和每點的強度定量確定，確定背景強度并被減掉

４.對照點，或是額外加入的序列，或是報道基因，或是每個樣本的總的熒光信號強度，來幫助校正兩種熒光染料的標(biāo)記差異和檢測效率５.兩個樣本中的每個基因信號用控制好的強度進行掃描測量６.經(jīng)相關(guān)軟件分析圖像，即可以獲得有關(guān)生物信息。芯片的掃描灰度圖

(對照)（處理）數(shù)據(jù)分析（復(fù)雜）一位科學(xué)院院士說，“以后生物實驗室中要有50%-70%的人從事生物信息學(xué)工作”呢。而且據(jù)統(tǒng)計，國際生物芯片的專利62%都集中在數(shù)據(jù)分析領(lǐng)域，可見這一方面確實是芯片研究領(lǐng)域的重點和焦點。很多芯片產(chǎn)品的供應(yīng)商都有提供服務(wù)項目。

靠自己

數(shù)據(jù)的描述

目的：是通過圖形對數(shù)據(jù)的分布情況進行初步的判斷。散點圖是一種常用的方法.遠離對角線的基因為表達差異明顯的基因。聚類分析計算樣本（這里指芯片上各個點掃描得到的數(shù)據(jù)）間的距離，以判斷性質(zhì)是否相近．聚類方法的局限:１.要聚類結(jié)果要明確就需分離度很好的數(shù)據(jù)２.由線性相關(guān)產(chǎn)生。但生物系統(tǒng)卻具有多因素和非線性的特點點,往往進行簡單的分類是無效的。層次式聚類：計算各數(shù)據(jù)點間的距離后把相近距離的聚為一組,再計算各組間的距離使之合并成更大的組,不斷重復(fù)這一過程直到最后聚成一組以樹狀結(jié)構(gòu)重新安排的數(shù)據(jù).其結(jié)果直觀而且能以樹狀結(jié)構(gòu)分支的長短來評價基因的相似性.培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞加入特定刺激物后，用基因芯片的方法研究其表達譜的變化。Time表示十二個時間組（最左邊一列未加刺激物），縱向排列的小方格表示基因。綠色表示下調(diào)87.5%，紅色表示上調(diào)8倍。經(jīng)過聚類分析后，相關(guān)的基因被聚集到各自的簇中。A類基因是與膽固醇合成相關(guān)的基因，B類是細(xì)胞周期相關(guān)基因，C類是立即早期反應(yīng)基因，D類是與信號傳導(dǎo)和血管生成相關(guān)的基因，E類是創(chuàng)傷修復(fù)、組織重塑相關(guān)基因。軟件和網(wǎng)址樹狀圖：美國斯坦福大學(xué)的Cluster軟件（下載網(wǎng)址），免費軟件。這是MichaelB.Eisen博士寫的一個以HierarchicalClustering、PCA、SOMs和K-meansClustering為主要功能的免費軟件，另外尚有數(shù)據(jù)過濾功能。在不斷升級中。用戶界面友好，操作簡單易懂，并帶有詳盡的說明書。其結(jié)果可直接被該網(wǎng)站的另一免費軟件TreeView讀取，輸出標(biāo)準(zhǔn)的樹狀圖。初級用戶學(xué)習(xí)使用也很方便。/e-library/－－芯片為研究手段發(fā)表的研究論文．NCBIRPGSWISSPRO研究方法１.海選：即將樣品在基因組芯片上篩選一遍，進行生物信息學(xué)分析，這樣可以將范圍縮小到幾個區(qū)域２.精細(xì)定位和測序：商品化的或者是定制的芯片進一步將范圍縮小３.功能飛行：用表達芯片對定位的基因，這一步分析也需要的參與。

NEW500K超大容量SNPs芯片基因定位標(biāo)記：第一代的RFLP（限制性片段長度多態(tài)性分析）第二代的STR（短串聯(lián)重復(fù)標(biāo)記，即微衛(wèi)星標(biāo)記

新近的SNP（單核苷酸多態(tài)性）

SNPs是指在基因組水平上由于單個核苷酸位置上存在轉(zhuǎn)換或顛換等變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP是可遺傳的變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上，并且SNP在基因組中廣泛存在，因此SNPs是一種非常適合做為基因標(biāo)記的研究方法。利用SNPs進行分析

準(zhǔn)確性（樣品中SNPs比較少）——ABI的TaqMan實時熒光PCR

全面性（e.g.全基因組的高密遺傳分析：特殊性狀相關(guān)基因定位查找）——基因芯片。目前已經(jīng)廣泛使用的是Affymetrix的10K，100K的GeneChipArrays（其中10K表示10,000個標(biāo)記）。還推出了500K（25萬SNP密度）利用AffymetrixHumanMapping500KArrays同時分析了500,000DNA標(biāo)記，獲得了一張有關(guān)記憶研究參予因子的遺傳圖譜，從中研究人員通過比對記憶力好的和記憶力差的人群，尋找在前者中存在，但在后者中缺失的遺傳變異，最終發(fā)現(xiàn)了Kibra基因。