不同氮源對(duì)兩株熱帶淡水微藻生長的影響

微藻是水體、濕地、海灘和其他環(huán)境中的一種常見藻類。年處理能力強(qiáng)的二氧化碳占世界二氧化碳固定量的40%以上。它是能量轉(zhuǎn)化和碳元素循環(huán)的重要支撐。微藻具有光合作用效率高、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、生長周期短、生物量高等特點(diǎn),是生產(chǎn)生物質(zhì)能的潛在資源,因此成為目前國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。微藻生物柴油是公認(rèn)的理想可持續(xù)發(fā)展能源,但偏高的成本成為限制微藻生物柴油產(chǎn)業(yè)化的主要瓶頸,因此通過高脂微藻的篩選、培養(yǎng)條件的優(yōu)化來提升單位體積微藻油脂的產(chǎn)量來降低成本是十分必要的。通過改變培養(yǎng)基化學(xué)成分的方法來控制微藻的新陳代謝,可以提高微藻單位體積油脂產(chǎn)量。氮是微藻生長所必需的基本元素之一,是構(gòu)成藻體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸及色素的重要元素,對(duì)于藻類的生長發(fā)育有著重要的作用。微藻可以利用的氮源范圍較寬,如無機(jī)氮源(氨態(tài)氮、硝態(tài)氮)、有機(jī)氮源(尿素、酵母膏、氨基酸等)。氮源類型對(duì)微藻的生長及油脂積累有著較為顯著的影響,且不同的藻種對(duì)氮源的適應(yīng)性有差異。本文以新分離的2株藻——網(wǎng)狀空星藻Coelastrumreticulatum及柵藻Scenedesumssp.為對(duì)象,研究不同氮源對(duì)它們的生長及總脂含量的影響,以期為開拓富油微藻種質(zhì)和加強(qiáng)油脂積累提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1淡水水體處理試驗(yàn)藻種網(wǎng)狀空星藻C.reticulatum及柵藻S.sp.分別分離自海口五公祠和金牛嶺公園的淡水水體,由海南大學(xué)材料與化工學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏。試驗(yàn)用藥品均為國產(chǎn)分析純(廣試)。1.2生物反應(yīng)器培養(yǎng)藻種均利用實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)的直徑8.0cm柱狀光生物反應(yīng)器進(jìn)行一次性培養(yǎng)。培養(yǎng)期間溫度控制在(26±2)℃,單側(cè)日光燈提供24h連續(xù)光照,光照強(qiáng)度150μmol·m_2s·_1,持續(xù)通入無菌空氣。1.3硝銨混合氮nh4no3以淡水BG11培養(yǎng)基為基礎(chǔ),選取4種氮源,分別為硝氮(NaNO3)、氨氮(NH4Cl)、有機(jī)氮(尿素)以及硝銨混合氮(NH4NO3),N濃度為17.6mmol·L_1。試驗(yàn)前對(duì)藻種進(jìn)行馴化培養(yǎng),以使之適應(yīng)不同氮源環(huán)境。初始接種OD680約為0.05,培養(yǎng)時(shí)間約2周。1.4測量1.4.1防水筆ph測定在試驗(yàn)周期內(nèi),每天測定培養(yǎng)液的OD680、pH以及色素含量。OD680以TU-1810紫外可見分光光度計(jì)測定;pH以pHscan30型防水筆型pH計(jì)測定;色素測定:取一定量的藻液,離心棄去上清,加入等體積甲醇50℃超聲提取20min,離心測定上清液的OD665、OD652和OD480,色素含量由下式計(jì)算:培養(yǎng)完成后,取10mL藻液經(jīng)已烘干稱量的0.45μm濾膜抽濾,置于80℃烘箱烘至恒質(zhì)量,測定最終干質(zhì)量,重復(fù)3次。1.4.2超聲-超聲法參照許瑾等的方法進(jìn)行總脂含量測定(略有改進(jìn)):培養(yǎng)結(jié)束時(shí)離心收獲藻體后凍干、研磨,準(zhǔn)確稱取0.2g左右藻粉,置于具塞玻璃離心管中,加入2~4mL二甲基亞砜甲醇(10%,V/V)溶液,50℃水浴超聲15min后,轉(zhuǎn)入冰水浴中繼續(xù)超聲30min。離心收集上清液,余下藻泥加入乙醚正己烷混合溶劑(1∶1,V/V)并使用磁力攪拌器4℃下攪拌至藻泥灰白,合并上清液,加入蒸餾水調(diào)節(jié)上清體積比例為甲醇:乙醚:正己烷:水=1∶1∶1∶1后靜置過夜,取上層置于已稱重的離心管中,氮?dú)獯蹈珊笾糜?0℃烘箱烘至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量。重復(fù)3次。1.5數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析采用SAS軟件單因素方差分析(ANOVA)中的duncan多重比較法,繪圖采用Excel和Origin軟件。2結(jié)果2.1種藻生長情況比較不同氮源條件下2種微藻生長的生長曲線見圖1,由圖可知,2株藻均在添加硝態(tài)氮(NaNO3)的情況下生長狀況最佳,而在添加銨態(tài)氮(NH4Cl)條件下生長狀況最差;添加銨硝混合氮(NH4NO3)條件下,2種藻生長速度也都快于銨態(tài)氮(NH4Cl)。2株微藻收獲時(shí)干質(zhì)量如表1所示,2株藻分別在添加NaNO3和NH4Cl的情況下獲得了最高干質(zhì)量(分別為(0.72±0.08)g·L_1和(0.80±0.03)g·L_1)和最低干質(zhì)量(分別為(0.62±0.04)g·L_1和(0.50±0.02)g·L_1)。2.2微藻ph的變化不同氮源存在下2株藻培養(yǎng)液的pH變化見圖2,可知在培養(yǎng)期間2株微藻的NaNO3、尿素組pH波動(dòng)均較小,而兩株微藻的NH4Cl組pH則自接種時(shí)開始迅速下降,最低pH3.09出現(xiàn)于S.sp.的NH4NO3組第11天。根據(jù)生長狀況及pH變化,可以推測C.reticulatum和S.sp.的最佳生長pH可能分別在8.5~10和8.5~9.5。2.3ssp.尿素對(duì)不同氮源對(duì)于C.reticulatum色素的積累并無明顯影響,各組在5d均開始進(jìn)入平穩(wěn)期,而NH4Cl組的葉綠素a自7d開始出現(xiàn)明顯下降,一直持續(xù)到培養(yǎng)結(jié)束(圖3)。Ssp.尿素組和NaNO3組色素增幅較快。其中尿素組葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素的最高含量出現(xiàn)在第7天左右,分別為6.235、3.267、3.338μg·mL_1,NaNO3組葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素的最高含量亦出現(xiàn)在第7天左右,分別為5.663、2.704、3.157μg·mL_1,而此時(shí)它們均已進(jìn)入平穩(wěn)期(圖1b),8d后各色素開始出現(xiàn)下降趨勢,其中尿素組下降速度較快(圖4)。2.4氮源對(duì)微藻總脂產(chǎn)量的影響C.reticulatum及S.sp.均以NH4Cl組總脂含量最高(圖5),分別為(38.35±1.32)%和(30.24±3.13)%。二者NaNO3組和NH4NO3組間總脂含量差異均不明顯(p>0.05),其他各組之間差異均顯著(p<0.01)。結(jié)合2株微藻的NH4Cl組生長情況均不佳,推測該藻可能是因?yàn)椴荒芎芎玫乩娩@態(tài)氮,因而在銨態(tài)氮存在的條件下造成了“缺氮”假象,造成油脂大量積累,最終造成NH4Cl組總脂含量較高。此外,NH4NO3組硝態(tài)氮的濃度為NaNO3組的一半,并且前者pH也較后者不穩(wěn)定,但二者總脂含量差異不明顯,說明pH的變動(dòng)與硝態(tài)氮減半對(duì)2株微藻油脂合成并無明顯影響。2種藻不同氮源條件下單位體積總脂產(chǎn)量見表2,C.reticulatum和S.sp.的單位體積總脂產(chǎn)量均以NaNO3組最佳,分別高達(dá)199.26mg·L_1和190.76mg·L_1,可見二者非常適宜作為微藻生物柴油的開發(fā)對(duì)象。另外筆者還發(fā)現(xiàn),在不添加氮源的情況下,C.reticulatum的總脂產(chǎn)量可高達(dá)386.03mg·L_1,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于NaNO3組。3討論3.1銨態(tài)氮對(duì)微藻生長和復(fù)育的影響目前關(guān)于氮源對(duì)微藻生長影響的相關(guān)研究較多,但結(jié)論不盡相同,如Li等研究硝態(tài)氮(NaNO3)、有機(jī)氮(尿素)與銨態(tài)氮((NH4)2CO3)對(duì)富油新綠藻Neochlorisoleoabundans的影響,結(jié)果表明添加銨態(tài)氮的藻液生長狀況最差,這與本研究中的結(jié)果相同;張青田等的研究結(jié)果表明纖細(xì)角毛藻Chaetocerosgracilis、赤潮異彎藻HeterosigmaakashiwoHada)、亞歷山大藻Alexandriumsp.等3種藻在銨態(tài)氮(NH4Cl)存在的情況下生長狀況好于有機(jī)氮(尿素),而隱藻Chroomonassalinaf.adolenscens則相反。氮是諸多物質(zhì),如葉綠素、Rubisco等光合酶、構(gòu)成同化力的ATP和NADPH等的組成成分,因此對(duì)光合作用的影響很大。自然界中除少數(shù)藍(lán)藻具有自身固氮能力外,其他微藻必須從環(huán)境中吸收一定的氮源以滿足其生長的需要,且不同的藻種對(duì)氮的種類和濃度需求不同。一般認(rèn)為微藻最容易利用銨態(tài)氮,但是隨著NH4+被利用,培養(yǎng)液的pH逐漸下降,以至于抑制微藻的生長,因而高濃度的銨鹽反而會(huì)抑制微藻的生長。但是在本研究中,2種藻在銨態(tài)氮存在的情況下生長情況一直不佳,說明本實(shí)驗(yàn)所涉及的2種藻更加偏好于硝態(tài)氮,其原因可能是2株藻均分離自流動(dòng)性較好的淡水水體中,導(dǎo)致水體中富含可將氮元素(死亡動(dòng)、植物分解所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、氨基酸等)分解為亞硝酸鹽并最終氧化為硝酸鹽的好氧細(xì)菌,使其富含硝酸鹽,藻類長期生存于該環(huán)境,逐漸適應(yīng)并演化出利用硝態(tài)氮的機(jī)制。本研究中銨態(tài)氮呈現(xiàn)對(duì)2種微藻生長的抑制作用也可能源于pH的變化,據(jù)報(bào)道,pH對(duì)微藻細(xì)胞生長的影響主要是通過引起細(xì)胞膜電荷變化和改變營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度來影響細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)物的吸收,或者是影響細(xì)胞內(nèi)多種酶的活性。由于本研究中一律采用一次培養(yǎng)法,期間未對(duì)培養(yǎng)基pH進(jìn)行控制,加之隨著微藻對(duì)氮源的吸收利用,因此會(huì)造成培養(yǎng)液的pH下降,這可能會(huì)影響銨態(tài)氮的離子化,使其無法通過離子通道而為微藻細(xì)胞所利用;另外,pH過低還可能影響相關(guān)代謝過程中的酶,從而抑制微藻的生長。3.2微藻生物柴油的生產(chǎn)氮源對(duì)于油脂積累及其成分的影響較大,目前一般認(rèn)為,氮缺乏條件下能夠引起微藻油脂大量積累,但會(huì)影響其生長;而氮充足條件下則利于微藻細(xì)胞的生長、分裂,但不利于油脂的積累。由于單位體積油脂產(chǎn)量是衡量微藻生物柴油經(jīng)濟(jì)性的指標(biāo),它同微藻的生物量及油脂含量均相關(guān),因此最大化單位體積油脂產(chǎn)量是提升微藻生物柴油可行性的基本條件。Suneerat對(duì)分離自泰國某淡水水域的藻種BotryococcusbrauniiKMITL2進(jìn)行油脂生產(chǎn)優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)初始氮濃度對(duì)于生物量的影響不大,但各組的總脂含量具明顯差異,且在氮濃度較低(86mg·L_1)情況下獲得了最高的油脂產(chǎn)量。Li等的研究結(jié)果表明,NaNO3對(duì)于N.abundans的油脂積累效果最佳,這與本實(shí)驗(yàn)中的結(jié)論相同。因此不同微藻的最利于油脂積累的氮源類型有所不同,本文所涉及的2株藻最高油脂含量雖均為NH4Cl組,但單位體積總脂產(chǎn)量以NaNO3組最高,因此二者的最適氮源均為硝態(tài)氮。4光合效率與硝態(tài)氮增長速率的關(guān)系(1)網(wǎng)狀空星藻C.reticulatum及柵藻S.sp.在NaNO3存在的條件下生長狀況最佳,最終生物量分別為(0.72±0.08)g·L_1和(0.80±0.03)g·L_1,與光合作用有關(guān)