人胰島素原基因的克隆與序列分析

1921年，bantin和其他人從狗胰腺分離并獲得胰島素。第二年，動物胰島素開始用于臨床治療糖尿病，并長期用于糖尿病的臨床治療。因為動物胰島素跟人源胰島素之間的存在氨基酸序列差異,長期使用會引起嚴重的免疫反應,在臨床上出現普遍的胰島素耐受問題。在臨床上使用人源胰島素始于1982年美國禮來公司生產的重組人胰島素針劑Humulin,我國臨床廣泛使用重組人胰島素的時間較晚,但發展很快。目前國內已有多家生物藥業公司生產重組人胰島素,大部分糖尿病患者已使用上重組的人胰島素,同時,在單峰胰島素,單體胰島素,短效、中效和長效胰島素的研究開發上也已取得許多顯著成績。重組人胰島素的使用大大提高了治療效果,但是由于通過微生物系統表達重組人源胰島素效率較低,生產成本高,注射人源胰島素的治療費用高昂。根據國際糖尿病協會統計,近年來,我國每年在糖尿病治療上耗費超過170億美元,人均年治療費用超過194美元,降低糖尿病醫療費用與眾多患者利益息息相關,提高胰島素的表達效率,降低胰島素生產成本是備受關注的熱點問題。人胰島素原由BCA3個短肽組成,全長86個氨基酸,分子量約為7kDa。重組胰島素多數通過原核誘導表達融合蛋白,其中常用的融合蛋白標簽分子量約為21kDa。因人胰島素原分子量小,在融合蛋白中的理論比例低于30%,其序列較短的結構特點限制了重組表達效率的提高。據此,本研究擬通過克隆人胰島素原多拷貝重復基因,構建相應原核表達載體,提高類人胰島素原在融合蛋白中的比例,以提高類人胰島素原的生產效率。1材料和方法1.1實驗材料1.1.1質粒及質粒原核表達質粒pET32a、大腸桿菌DH5α(EscherichiacoliDH5α)、大腸桿菌BL21(DE3+)(EscherichiacoliBL21),為廈門醫學高等專科學校中心實驗室保存,克隆質粒pMD19-T購自Takara公司。1.1.2酶法檢測rotemara基因表達Pfu高保真DNA聚合酶、FastDigest(快速限制性內切酶)BamHⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、SalⅠ、SacⅠ、NotⅠ、dNTPs、ProteinMarker均購于ThermoScientific公司,T4DNA連接酶、DNAmarkers購自Takara公司。DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、PCR產物純化試劑盒以及質粒小量抽提試劑盒,均購自北京Solarbio科技有限公司。Ni-NTA金屬螯合凝膠層析柱購自Merck公司,引物合成、Bradfore蛋白質濃度測定試劑盒均購于上海生物工程技術有限公司,IPTG、SDS、Urea、Tris等生化試劑購于Sigma公司。1.1.3儀器和實驗方法離心機(Sigma3-18K),PCR儀(Bio-RadS1000),蛋白質分離純化系統(GEAktapurifier),質譜儀(ABSCIEXTRIPLETOF5600),超聲波細胞破碎儀(寧波新芝,JY92-IIN),電泳儀(北京六一,DYCZ-25D),凝膠成像系統(GEQ300),凝膠掃描儀(GEimageIII)。1.2實驗方法1.2.1lyolys二肽短鏈的合成及篩選根據GenBank上發布的人胰島素原氨基酸序列(gi:186429),按大腸桿菌的密碼子偏愛性,將氨基酸序列重新翻譯并優化成可在大腸桿菌高效表達的基因序列(hINS-M);包含159個核苷酸序列,翻譯形成53個氨基酸序列,包括30個氨基酸短肽的B鏈,21個氨基酸短肽的A鏈,連接B、A鏈的C鏈,因為在成熟的胰島素中會被切除,在A、B鏈折疊的過程中,即使沒有C鏈參與也能夠順利完成折疊。因此,為了提高胰島素的表達效率,用LysLys二肽短鏈取代C鏈。詳細序列如下:1.2.2重組花殼把握根據重新優化設計的hINS-M序列,設計3個長引物對用于模板序列的克隆:hINS-M-F1+hINS-M-B1,hINS-M-F2+hINS-M-B2,和hINS-M-F3+hINS-M-B3。通過重疊PCR法克隆hINS-M序列,再設計一批擴增引物引入限制性內切酶識別位點,用于擴增片段的剪切、拼接,以及多拷貝重復基因的連接。在A、B鏈前后端引入胰蛋白酶特異性酶切位點,用于原核表達后的目的肽段與融合標簽的酶切分離和目的蛋白純化。設計的引物對如表1所示。1.2.3hbp擴增中hoi-m基因重復串聯序列的構建通過重疊PCR法克隆獲得hINS-M單基因序列,再通過PCR法引入限制性酶切位點,對各PCR產物進行酶切拼接,獲得不同拷貝數的hINS-M多基因串聯序列,其中單拷貝hINS-M序列通過引物對:BamHI-F+XhoI-B直接擴增hINS-M模板序列獲得,基因總長為177bp;2拷貝hINS-M序列的克隆:分別用引物對BamHI-F+XhoI-B和XhoI-F+NotI-B擴增hINS-M模板序列,用限制性內切酶XhoI分別酶切擴增產物,純化酶切產物后,用T4DNA連接酶連接酶切產物獲得目的2hINS-M2基因重復串聯序列,基因總長為351bp;3拷貝hINS-M序列的克隆:用引物對NotI-F+HindIII-B擴增hINS-M模板序列,用限制性內切酶NotI分別酶切擴增產物和2hINS-M,純化酶切產物后連接獲得目的3hINS-M3基因重復串聯序列,基因總長為522bp;4拷貝hINS-M序列的克隆:用引物對HindIII-F+SalⅠ-B擴增hINS-M模板序列,用限制性內切酶HindIII分別酶切擴增產物和3hINS-M,純化酶切產物后連接獲得目的4hINS-M4基因重復串聯序列,基因總長為693bp;5拷貝hINS-M序列的克隆:用引物對SalI-F+SacⅠ-B擴增hINS-M模板序列,用限制性內切酶SalI分別酶切擴增產物和4hINS-M,純化酶切產物后連接獲得目的5hINS-M5基因重復串聯序列,基因總長為870bp;6拷貝hINS-M序列的克隆:用引物對SacⅠ-F+EcoRI-B擴增hINS-M模板序列,用限制性內切酶EcoRI分別酶切擴增產物和5hINS-M,純化酶切產物后連接獲得目的6hINS-M6基因重復串聯序列,基因總長為1035bp。克隆流程如圖1所示:1.2.4pcr鑒定及其質粒表達以不同拷貝數hINS-M重復基因序列為模板,PCR擴增獲得一系列大小不同的目的DNA片段,瓊脂糖電泳后進行膠回收目的片段,分別連接到克隆質粒pMD19-T多克隆位點上。將連接好的克隆質粒轉化CaCl2法制備的DH5α感受態大腸桿菌,涂布LB平板培養基(含100μg·mL-1氨芐青霉素),37℃過夜培養后,隨機挑選3-5個克隆菌落,用pMD19-T質粒通用檢測與測序引物對RV-M(5’-GAGCG-GATAATTTCACACAGG-3’)和M13-47(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTC-CGAC-3’)進行PCR驗證插入克隆片段是否正確,挑選PCR檢測陽性克隆菌落,用LB液體培養基(含氨芐青霉素100μg·mL-1)37℃過夜培養,取部分菌液進行測序驗證,將克隆序列完全正確的克隆菌落進行擴大培養,提取質粒及菌株保存。分別用(1)BamHI+XhoI,(2)BamHI+NotI,(3)BamHI+HindIII,(4)BamHI+SalI,(5)BamHI+SacI和(6)BamHI+EcoRI限制性內切酶組合,分別對含1~6拷貝數hINS-M基因重復序列克隆片段的PMD19-T-xhINS-M(x=1~6)克隆質粒和原核表達質粒pET32a進行同步雙酶切。酶切體系為10×fastdigestbuffer10μL,相應限制性內切酶10u,克隆質粒/表達質粒10nmol,無菌超純水補充到100μL,混勻后37℃水浴酶切2h。酶切產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離,膠回收克隆基因片段和pET32a質粒酶切大片段產物。將回收的克隆基因片段與pET32a質粒大片段按10:1的物質的量比進行混合,用T4DNA連接酶于16℃連接過夜。取適量連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5α,LB平板培養基(含氨芐青霉素100μg·mL-1)37℃過夜培養,隨機挑選單克隆菌落3~5個,PCR鑒定為陽性克隆后,用LB液體培養基(含氨芐青霉素100μg·mL-1)37℃、180r·min-1振搖培養過夜,取部分菌液進行測序驗證,將基因序列正確的克隆菌進行擴大培養,提取質粒及菌株保存。1.2.6超聲破碎液的制備將誘導表達菌液4℃、5000g離心10min,分別取上清液(組分1)和菌體沉淀,將菌體用0.1MPBS(pH7.4)重懸后,冰浴中超聲破碎:功率200W,總超聲時間10min,超聲工作時間和間隔時間均為10s。將超聲破碎液4℃、12000g、離心10min,取上清(組分2)。可能含有包涵體的沉淀部分,用包涵體蛋白裂解液(7Murea,2MThiourea,4%chaps,20mMDTT,25mMTris,pH8.0)重溶,16℃、12000g、離心10min取上清液(組分3)。Bradford法測定各組分總蛋白濃度,取30μg總蛋白與2×SDSloadingbuffer混合,95℃水浴3min,4%濃縮膠結合10%分離膠進行SDS電泳分離,考馬氏亮藍染色后用ImagemasterⅢ凝膠專用掃描儀掃描電泳圖譜,分辨率為300dpi。1.2.7原核基因型mds-m基因多態性表達用Bio-RadQuantityOne軟件對各原核表達融合蛋白的染色條帶進行光密度分析,計算相對含量,并通過方程式(一)計算hINS-M的相對含量。其中hINS-M%表示類人胰島素原的相對誘導表達效率;x表示原核表達載體中hINS-M基因拷貝數量;0.67表示在本項目中構建的原核表達質粒(pET32a)中hINS-M基因的表達產物類人胰島素原的分子量(0.67kDa);MWTrx-xhINS-M表示整個融合蛋白的分子量,其大小為融合標簽約21kDa,加上x拷貝hINS-M重復基因表達產物的分子量,約為0.67×XkDa;RTrx-xhINS-M為融合蛋白在表達菌全蛋白中的相對含量。1.2.8豬胰蛋白酶液制備單次給藥法將SDS電泳凝膠的目的蛋白條帶用手術刀片小心切下,切成1mm3左右的小碎塊,放入1.5mL干凈的離心管,用乙醇:超純水:乙酸(5:4:1)的脫色液50℃、250r·min-1振搖脫色,間隔30min換一次脫色液至脫色完全,5000g離心2min,棄盡上清液,膠顆粒中加入500μL含50%乙腈的25mMNH4HCO3水溶液,室溫振搖脫水10min,重復兩次后,加入100%乙腈振搖脫水兩次,每次5min,離心棄盡乙腈,離心真空干燥10min。向膠顆粒中小心加入10μL10ng·μL-1的豬胰蛋白酶,2000g、4℃離心1min,冰浴靜置30min使酶液被膠粒完全吸收,補充10μL25mMNH4HCO3水溶液,使膠粒恰好被溶液完全覆蓋,37℃靜置酶切6h。加入50μL含0.1%甲酸的50%乙腈水溶液終止酶切反應,吸出膠粒外的酶解液后,再向膠粒加入50μL含0.1%甲酸的乙腈,吸出酶解液,重復1次后合并所有酶解液,真空離心濃縮至干燥后,用50μL含0.1%甲酸和5%乙腈的無菌超純水重新溶解提取肽段,用nanoLC-ESI-Q-TOF-TOF質譜進行蛋白質定性分析。2結果與討論2.1pcr擴增檢測通過長引物對重疊PCR法克隆優化設計的hINS-M基因,擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳,結果如圖2。擴增獲得長度約為159bp大小基因片段,與目的擴增片段大小相符。膠回收該擴增片段,連接到PMD19-T克隆質粒,測序證實獲得的克隆基因片段即為優化設計的hINS-M基因序列,表明成功獲得單拷貝hINS-M基因。2.2克隆基因片段與原核表達載體的連接通過表1所列的引物對和圖1所示的基因克隆流程,PCR法克隆含1~6拷貝hINS-M重復序列,將這些擴增片段膠回收后,連接到克隆質粒PMD19-T,轉化感受態大腸桿菌DH5α,挑選陽性克隆,瓊脂糖凝膠電泳檢測克隆質粒片段大小約為3-5kb,表明擴增片段與克隆質粒連接成功(圖3)。PMD19-T-xhINS-M(x=1~6)克隆質粒與pET32a原核表達質粒進行同步雙酶切,用T4DNA連接酶將克隆基因片段連接到表達質粒pET32a,轉化后挑選陽性克隆,提取pET32axhINS-M(x=1~6)質粒,雙酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳分析,結果如圖4所示,分別獲得大小與1~6hINS-M基因序列大小相符的系列片段(圖4),表明克隆基因片段與原核表達載體同步雙酶切及連接構建原核表達載體成功。將獲得的原核表達質粒的插入基因片段再次測序,與設計的基因序列進行比對分析,證實插入片段的核苷酸序列與優化設計的目的序列完全相同,表明構建的原核表達質粒(pET32a-xhINS-M,x=1~6)可用于后續原核表達分析。2.3hins-m原核分析2.3.1sds-計劃電泳分析為了明確該融合表達蛋白在表達菌中的分布形式,分別提取了表達菌發酵液、表達菌菌體破碎液上清,菌體破碎沉淀組分中的蛋白成分,進行SDS電泳分析,結果如圖6所示,融合蛋白主要存在于菌體破碎沉淀組分中,表明融合蛋白在大腸桿菌內高效誘導表達后,主要以不溶性的包涵體形式存在。2.3.2pet-32a-xhns-m原核表達載體誘導表達的融合蛋白表達含1~6拷貝hINS-M重復基因的pET-32a質粒,原核誘導表達產物SDS電泳結果如圖7所示。各融合蛋白分子量與1~6拷貝數hINS-M基因誘導表達目的融合蛋白理論分子量相符,分別約為27.7,34.3,40.8,47.4,54.0和60.6kDa。表明各拷貝數的pET-32axhINS-M原核表達載體均獲得成功誘導表達。圖7顯示,pET-32a-xhINS-M原核表達載體誘導表達的融合蛋白,在表達菌總蛋白含量中的比率具有差異性。各原核表達融合蛋白條帶(Trx-hINS-M)相對含量進行光密度分析,并通過方程式(一)計算hINS-M的相對含量,結果如表2所示。2.3.3用mri-m原核分析蛋白2.3.4質粒誘導表達hINS-M、2hINS-M和3hINS-M分子量大小相對應的蛋白質條帶酶解產物的nanoLC-ESI-Q-TOF-TOF質譜鑒定結果顯示各條帶均為人胰島素原(表3,圖9),表明pET32a-4hINS-M原核表達質粒在大腸桿菌中成功誘導表達獲得類人胰島素原蛋白。3多貝人胰島素原融合蛋白表達效率重組表達人胰島素是臨床使用胰島素的主要來源,其推廣使用,使眾多糖尿病患者擺脫了使用其它動物來源胰島素產生的嚴重副作用。目前全球重組生產胰島素產量已經達到近千噸,主要以大腸桿菌原核表達融合蛋白為主要生產模式,少量用酵母發酵分泌生產人胰島素。但是,大腸桿菌發酵生產重組人胰島素的生產效率依舊不夠理想,生產成本高,臨床使用胰島素的治療費用依舊高昂,提高胰島素生產效率,對降低糖尿病治療費用具有重要意義。許多研究致力于通過大腸桿菌高密度發酵、胰島素基因密碼子優化、以及連續發酵生產等途徑,顯著提高了融合蛋白的表達效率。但是,人胰島素原氨基酸序列較短,只有86個氨基酸,分子量小,約為9000Da,而常用的原核表達載體表達的融合蛋白標簽,如pET32a的TRX標簽分子量大約為21kDa。因此,原核誘導表達的人胰島素原,在整個融合蛋白中的理論比例不會超過30%,成為制約提高原核誘導表達人胰島素原融合蛋白效率的瓶頸。本文通過PCE克隆與酶切拼接等方法,獲得多拷貝人胰島素原多基因串聯序列,并將其鏈接到原核表達質粒中,使誘導表達的融合蛋白中含有多拷貝人胰島素原序列,提高人胰島素原在融合蛋白中的比例。理論上單拷貝人胰島素原在融合蛋白中的比例約為30%,雙拷貝人胰島素原的比例則可提高到46.15%,十拷貝人胰島素原的比例則可提高到81.08%。因此,在融合蛋白表達效率一致的條件下,提高融合蛋白中人胰島素原的拷貝數,可顯著提高人胰島素原的理論生產效率。但是融合蛋白的表達效率,跟融合蛋白的分子量大小是緊密相關的,當融合蛋白的分子量超過一定值時,融合蛋白表達效率會顯著降低。因此,隨著人胰島素原拷貝數量的增加,融合蛋白表達效率可能相應降低。本研究發現,含四拷貝人胰島素原重復基因的融合蛋白表達效率最為理想,其表達的人胰島素原占總蛋白量約為28.22%,而單拷貝人胰島素原基因融合表達人胰島素原占總蛋白量約為10.05%。因此,本文認為,通過提高人胰島素原基因拷貝數以提高重組表達人胰島素原的生產效率具有顯著效果。1.2.5+大腸桿菌tr-1-3hmins-m融合蛋白原核表達質粒的構建將含克隆基因片段的pET32a-xhINS-M(x=1~6)表達質粒轉化感受態大腸桿菌BL21(DE3+),挑取陽性單克隆菌落,用LB液體培養基(含氨芐青霉素100μg·mL-1)37℃、250r·min-1振搖培養至OD600約為0.6,加入IPTG至終濃度為1mmol·L-1,28℃低溫誘導表達8h,同時設置一組pET32a空載質粒轉化菌和不加IPTG的非誘導表達菌為實驗對照。構建的原核表達質粒pET-32a-hINS-M,轉化到大腸埃希菌BL21(DE3+),經1mMIPTG誘導表達后,表達產物用SDS電泳分析檢測,結果如圖5所示。與無質粒的BL21(DE3+)大腸桿菌比較,pET-32ahINS-M轉化菌表達產物中,多出一個大小約為28kDa的蛋白條帶,其分子量大小與目的融合蛋白片