植物組織培養:指在無菌條件下，將離體的植物器官、組織、細胞或原生質體，培養在人工配制的培養基上，人為控制培養條件，使其生長、分化、增殖，發育成完整植株或生產次生代謝物質的過程和技術。也稱為離體培養。外植體:凡是用于離體培養的細胞、組織或器官統稱為外植體。?組織培養六要素：無菌條件外植體人工培養基人工條件:溫度、光強、光照時間細胞全能性:增殖、分化、發育成完整植株培養容器:能進行氣體交換培養材料類型：組織培養:指以分離出植物各部位的組織（如分生組織、形成層、薄壁組織等）或已誘導的愈傷組織為外植體的離體無菌培養，是狹義的組織培養。器官培養:植物的六大器官的無菌培養胚胎培養:幼胚、成熟胚、胚乳、胚珠、子房的無菌培養細胞培養:指對單個細胞或較小細胞團的離體無菌培養，獲得單細胞無性繁殖系。原生質體培養:指以除去細胞壁的細胞（原生質體）為外植體的離體無菌培養。其他:次生代謝物生產、脫毒培養、人工種子等。按照培養過程分為:初代培養和繼代培養按照培養基類型分為:液體培養和固體培養按照培養目的分:愈傷組織培養、分化培養和生根培養主要研究任務：細胞、組織、器官等在離體培養下的：?營養條件、激素、培養條件?形態發生?脫毒方法與機理?再生植株的遺傳穩定性?種質資源離體保存的機理與方法?細胞離體融合機理與方法細胞全能性:指植物體的任何一個有完整細胞核的活細胞都具有該種植物的全套遺傳信息和發育成完整植株的能力。植物細胞的全能性是潛在的，要實現植物細胞的全能性，必須具備一定的條件：細胞與植株分離，脫離植株的控制；創造適合于細胞生長和分化的培養基和培養條件；要有成功的再生體系，即獲得再生植株。植株再生的過程即為植物細胞全能性表達的過程，一般經過脫分化和再分化兩個階段。細胞分化:指細胞在分裂過程中發生結構和功能上的改變，逐漸失去分裂能力，而形成各類植物組織和器官。由種子萌發到長成完整植株，這是胚性細胞不斷分裂和分化的結果。細胞分化形成不同的器官和組織，即細胞分化導致形態發生組織培養的形態發生有兩種途徑:一種是器官發生，另一種是體細胞胚胎發生脫分化:指植物組織培養中離體植物器官和組織的成熟細胞或已分化的細胞回復到分生狀態的過程，即誘導成為愈傷組織的過程。愈傷組織:是指在人工培養基上經誘導后外植體表面上長出來的一團無序生長的薄壁細胞。脫分化的難易程度與植物的種類、組織和細胞的狀態有關。一般單子葉植物比雙子葉植物難；成熟的植物細胞和組織比未成熟的植物細胞和組織難；單倍體細胞比二倍體細胞難。再分化:指離體的植物細胞或組織經脫分化培養后再次進行分化，形成新的細胞、組織、器官的過程。再分化有兩種方式：一種是器官發生，一種是胚胎發生形態建成（愈傷組織到再生植株）先芽后根，這是最普遍的發生方式；先根后芽，但芽的分化難度比較大；在愈傷組織塊的不同部位上分化出根或芽，再通過維管組織的聯系形成完整植株。通過在愈傷組織表面或內部形成胚狀體，是愈傷組織形態發生的特殊方式。影響組培苗遺傳穩定性的因素基因型繼代次數與繼代時間形態發生:以莖尖、莖段發生不定芽，變異率低以花器官誘導的植株，變異率高胚狀體發生途徑，變異率低愈傷組織懸浮培養分化不定芽，變異率較高外源激素:激素影響細胞有絲分裂，高濃度激素作用下，細胞分裂和生長激素加快，不正常分裂頻率增高，再生植株變異增多。減少變異，提高遺傳穩定性的措施（1） 選取具有分生點的莖尖或幼嫩的器官為外植體（2） 縮短繼代時間，減少繼代次數（3） 采用胚狀體發生方式（4） 采用適當的激素種類和濃度（5） 減少或不使用容易引起誘變的化學物質植物離體快速繁殖特點:繁殖系數大，周年生產，繁殖速度快，苗木整齊，可工廠化生產。次生代謝物:植物組織培養能產生很多種藥物，主要有苷類、生物堿、固醇類、醍類、黃酮類、蛋白質及其它生理活性物質。植物組織培養：（1） 是指分離單個或多個細胞或植物體的一部分，在人工配制的培養基上進行培養，使之長成一株完整植物體的過程。按照外植體的不同，組織培養可分為植株培養、胚胎培養、器官培養、細胞培養和原生質體培養。（2） 理論依據---細胞全能性（3） 培養條件可以人為控制；生長周期短，繁殖率高；管理方便，利于工廠化生產的突出特點，因而發展迅速。（4） 農業生產上的應用主要體現于以下幾個方面:快速繁殖優良苗木；獲得脫毒苗；育種上應用；工廠化育苗。細胞分化:指細胞在分裂過程中發生結構和功能上的改變，而形成各類植物組織和器官。脫分化:也稱去分化，一個已停止分裂的成熟細胞轉變為分生狀態并形成未分化的愈傷組織的現象叫脫分化。脫分化的機理:脫分化誘導期間會導致細胞膜透性改變，細胞核增大，內質網范圍擴大，多核糖體形成，過氧化物酶增加，蛋白質和酚類物質合成活躍等。影響脫分化的主要因素：損傷。切割損傷的刺激，促使細胞增殖。在誘導愈傷組織時常加入生長素，但配合細胞分裂素的效果更好。弱光或黑暗條件有利于脫分化中的細胞分裂。外植體的狀態。不同生理年齡和不同季節都會有不同的培養反應。植物種類的差異。一般雙子葉植物比單子葉植物及裸子植物容易。誘導期:是細胞分裂的準備時期，是愈傷組織形成的起點。特點：處在靜止狀態的成熟細胞通過一些刺激因素和激素的誘導作用，使其細胞內合成代謝活動加強，迅速進行蛋白質和核酸物質的合成，RNA含量迅速增加，細胞核體積明顯增大，細胞大小變化不大。分裂期:指細胞通過一分為二的分裂，不斷增生子細胞，即發生脫分化的過程。特征：細胞分裂快，結構疏松，缺少結構，淺而透明。細胞體積迅速變小。當細胞體積最小，細胞核和核仁最大，細胞內無大液泡，RNA含量最高時，標志細胞分裂進入了高峰期。形成期：是指外植體細胞經過誘導期和分裂期后形成無序結構的愈傷組織。特征：細胞的平均大小相對穩定，不再減小。形成瘤狀結構的外表和內部分化；出現多種類型的細胞。MS培養基：無機鹽和例子濃度較高，為較穩定的平衡溶液。起養分的數量和比例較合適，可滿足植物的營養和生理需要。硝酸鹽含量較其他培養基為高，廣泛地運用于植物的器官、花藥、細胞和原生質體培養。B5培養基：含有較低的銨，適于雙子葉植物，特別是木本植物。White培養基：無機鹽數量較低，適于生根培養。N6培養基：KNO3和(NH4)2SO4含量高。常用于禾谷類植物的花藥培養。細胞及原生質體培養。植物的離體器官發生:指從植物葉片、子房、花藥、胚珠、葉柄等，誘導出愈傷組織，由愈傷組織上誘導不定芽，進一步發育，形成完整植株。特點：這種方法從原來成熟組織上重新誘導出分生組織，發生單芽或叢生芽。器官發生再生植株的方式：A先形成芽，芽的基部后產生后根；B先形成根，根上再出芽；C愈傷組織的不同部位形成芽和根，然后形成微管束組織把兩者結合起來植物體細胞胚胎發生:植物離體培養的細胞誘導分化出類似胚的結構，進而長出完整植株的過程稱為植物體細胞胚胎發生，形成的類似胚的結構稱為體細胞胚或胚狀體。過程：愈傷組織形成/胚性愈傷組織形成/胚狀體形成/胚萌發和成苗影響植物離體形態發生的因素：植物種類和基因型培養材料的生理狀態二徑美苴一三 培養基四 培養條件＞在植物組織培養中，主要目標是誘導愈傷組織形成和形態發生，使一個離體的細胞、一塊組織或一個器官的細胞，通過脫分化形成愈傷組織，并由愈傷組織再分化形成植物體。＞胚狀體發生途徑與器官發生途徑形成植株的區別：最根本的特征是具有兩極性，即在發育的早期階段，從其方向相反的兩端分化出莖端和根端；而不定芽和不定根都為單向極性。胚狀體的維管組織與外植體的維管組織無解剖結構上的聯系，而不定芽或不定根往往總是與愈傷組織的維管組織相聯系。胚狀體的維管組織的分布是獨立的“Y”字形，而不定芽的維管組織無此現象。＞影響植物離體形態發生的因素有不同品種的基因型、外植體的選擇狀態、培養基和培養條件。植物組織培養的完整過程一般分為：■培養基的選擇和培養條件的確定■外植體選擇與處理■接種、初代培養■繼代培養■生根培養■試管苗的馴化移栽成活培養基的成分包括■水■無機鹽■有機物■植物激素■培養物的支持材料無機鹽：大量元素：主要有N、P、K、Ca、Mg、S等。微量元素：主要有Fe、Mn、Cu、Mo、Zn、Co、B等。缺素癥：?氮：不能形成導管，表現花色素苷的顏色?鉀和磷：細胞過度生長?硫：明顯腿綠?鐵：細胞分裂停止，失綠癥狀?硼：細胞分裂停滯，細胞伸長?錳和鉬：影響細胞伸長有機物：?糖：提供碳源、能量?維生素：VB1對愈傷組織的產生和生活力有重要作用；在低濃度的細胞分裂素下，特別需要添加VB1、VB6才能促進根的生長；VB5與植物代謝和胚的發育有一定關系；VC有防止組織褐變的作用。?肌醇：促進愈傷組織的生長、胚狀體和芽的形成，對組織和細胞的繁殖、分化也有促進作用。對細胞壁的形成也有作用。?氨基酸：有機氮源?天然有機復合物植物激素：?生長素：主要用于誘導愈傷組織形成，促進根的生長。協助細胞分裂素促進細胞分裂和伸長。?細胞分裂素：誘導不定芽的分化和莖、苗的增殖。?赤霉素：刺激在培養中形成的不定胚發育成小植株，促進幼苗莖的伸長生長。外植體的選擇：植物基因型：雙子葉植物易于單子葉植物生理狀態：幼嫩、年限越短的組織取材季節：在其生長開始的季節選取植物的長勢：生長健壯的器官或組織取材部位：取易出愈傷組織的部位外植體大小：在0.5?1.0cm為宜無菌概念：無菌的范疇是指經高溫灼燒或一定時間蒸煮過后的物體，或經其他理化滅菌方法處理后的物體等都是無菌的。滅菌與消毒的含義及其差異：■所謂滅菌是指用物理或化學的方法，殺死物體表面和孔隙內的一切微生物或生物體，即把所有有生命的物質全部殺死；■而消毒是指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發生危害作用。■滅菌與消毒的主要區別在于前者殺菌強烈，能殺死所有活細胞；后者作用緩和，主要殺死或抑制附在植物材料表面的微生物，但芽胞、厚垣孢子一般不會死亡。但是，滅菌與消毒是相對的，如果消毒時間過長或消毒劑濃度過高，也可殺死全部活的細胞，消毒就成為滅菌了。反之，滅菌劑只能起到消毒作用。滅菌方法：壓力蒸汽滅菌、灼燒滅菌、過濾滅菌、紫外線滅菌植物組織培養過程：離體的植物器官、組織、細胞(脫分化)，愈傷組織(再分化)，根芽，再生苗。植物組織培養條件：溫度、光照、濕度、滲透壓、pH值、培養基、無菌條件。提高試管苗馴化移栽成活率的措施：提高組培苗質量。及時出瓶馴化，避免組培苗老化。選擇適當的移栽基質，要求疏松、保水和保肥，易滅菌，常用的基質有蛭石、珍珠巖、營養土等。移栽前根系處理，根部培養基清理掉，不能傷根和葉。移栽后的溫度和濕度控制，注意溫度和保濕。適當采取遮陰措施，可降低蒸騰失水，也可避免強日照對葉片的灼傷。加強肥水管理和病蟲害防治。植物組織培養基本技術流程包括培養基的配制、外植體的選擇與處理、接種和繼代培養、試管苗的移栽以及培養環境條件控制等。培養基的成分有水、無機鹽、有機化合物、激素、凝固劑等。一般多選擇莖段、莖尖、葉片、花藥等幼嫩的組織作為組培的外植體滅菌的方法有壓力蒸汽滅菌、過濾、灼燒和紫外滅菌。培養條件：溫度23-27濕度70-80%PH值5.5-6.0創設從試管苗生境逐漸向室外環境轉化的過渡條件，以確保試管苗的移栽成活率。外植體：>一般來自無菌種子發芽產生的幼根>植株根系經消毒處理后的切段普通莖尖培養：取材：挑選雜菌污染少，生長不久的莖尖。木本植物可在取材前對莖尖噴幾次滅菌藥劑。以保證材料不帶或少帶雜菌。用于普通莖尖培養，可先從植物的莖、藤或匍匐枝上切取2cm以上的頂梢。滅菌：將采到的莖尖切成0.5-1.0cm，并將大葉除去，休眠芽預先剝除鱗片。將莖尖置于流水沖洗2?4小時(視干凈程度)，再在70%的酒精中處理10-30秒，然后30%的次氯酸鈉中浸10-15分鐘，最后用無菌水沖洗3-4次，或者用0.1-0.2%的氯化汞滅菌5-10分鐘，無菌水沖洗5次以上。接種：為了減少污染，可在接種前再剝掉一些葉片，使莖尖為0.5cm左右。有些植物的莖尖由于多酚氧化酶的氧化作用而發生褐化，使培養基變褐，影響材料的成活。所以在接種時，不能用生銹的解剖刀，動作要敏捷，隨切隨接，減少傷口在空氣中暴露的時間。培養：初代培養，繼代培養，誘導生根，馴化移栽。脫毒培養：取材，滅菌，接種，培養葉的培養：取材與滅菌，接種，培養(光培養)■植物器官培養主要是指離體的根、莖、葉、花器和果實、種子的無菌培養，是植物組織培養中最主要的一個方面。■植物器官培養不僅是研究器官生長、營養代謝、生理生化、組織分化和形態建成的最好材料和方法，而且具有重要的應用價值。植物細胞培養：指對植物器官或愈傷組織上分離出來的單細胞(或小細胞團)進行培養，形成單細無性系或再生植株的技術。單細胞分離：1.機械法：葉片研碎、過濾、離心2.酶解法：酶降解膠層，獲得游離的細胞團單細胞培養方法：平板培養法:分散的植物細胞接種于含薄層固體培養基的培養皿內的培養過程稱為平板培養法。看護培養法:從懸浮培養物或脆弱愈傷組織上分離單細胞，濾紙置于活躍生長的愈傷組織上，分離的單細胞放在濾紙表面，進行培細胞養的方法。微室培養法:懸浮單細胞接種于凹玻片或玻璃環與蓋玻片組成的微室內的固體培養基中的培養方法。條件培養基培養：條件培養基是在培養基中加入高密度的細胞進行培養。細胞懸浮培養的建立：愈傷組織的誘導，懸浮系的建立與繼代培養，懸浮細胞的生長動態，影響懸浮細胞生長的因素，懸浮細胞同步化饑餓法：饑餓導致的細胞分裂受阻常常是使細胞不能合成DNA，即不能進入S期，或細胞分裂不能進行，即不能進入M期。因此，通過饑餓法可以獲得處于G1和G2期的同步化細胞。抑制劑法：通過一些DNA合成抑制劑處理細胞，使細胞滯留在DNA合成前期，可獲得處于同一細胞周期(G1)的同步化細胞。原生質體：脫去細胞壁的細胞叫原生質體。原生質體融合意義：可實現遠緣雜交，獲得種間雜種，克服有性雜交配子不親合性；可獲得含另一親本非整倍體雜種或胞質雜種，且獲得的遺傳變異范圍極廣；一次操作可實現兩個以上親本的融合作用可獲得呈現雙親個體基因型總和的雜種；可形成有性生殖障礙植物的種間雜種；■細胞分離的方法有機械法和酶解法■單細胞培養方法有平板、看護、微室、條件培養基等培養法■細胞懸浮培養過程：愈傷組織誘導，懸浮系的建立和培養，懸浮細胞的生長動態，懸浮培養細胞的同步化等■原生質體培養過程：原生質體分離及純化，活力測定，細胞壁再生及細胞分裂，愈傷組織和胚狀體形成，植株再生。■原生體質融合的影響因素：PEG