不同疏水參數(shù)有機溶劑對黃瓜蛋白酶及其固定化酶活性的影響

近年來，非水酶學(xué)的研究十分活躍，表明非機合劑中酶的巨大應(yīng)用潛力。有關(guān)學(xué)者較為詳細(xì)地研究了有機溶劑對酶活的抑制作用及低體積分?jǐn)?shù)有機溶劑對酶的激活作用等1材料和方法1.1材料和試劑部分純化的木瓜蛋白酶粗酶由廣西熱帶作物研究所提供;尼龍布(0.147mm,100目)和殼聚糖(脫乙酰度≥90%)購于試劑公司;酪蛋白,美國Sigma公司產(chǎn)品。本試驗所用的15種有機溶劑——二甲基亞砜、1,4-二氧六環(huán)、甲醇、乙腈、乙醇、丙醇、四氫呋喃、乙酸乙酯、丁醇、戊醇、己醇、苯、甲苯、環(huán)己烷和十二醇的log1.2氨基酸消光系統(tǒng)的測定取0.2mL(1g/L)PA溶液,加入0.25mL激活劑(0.1mol/LpH7.2磷酸緩沖液,內(nèi)含36mmol/L半胱氨酸和0.6mmol/LEDTA)和2.3mL有機溶液,用0.1mol/LpH7.2磷酸緩沖液配制,使反應(yīng)體系中有機溶劑的體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)到5%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,50%,60%和70%,于37℃下預(yù)熱10min,加入37℃預(yù)熱的10g/L酪蛋白溶液0.5mL,準(zhǔn)確反應(yīng)10min(可溶性有機溶劑如二甲基亞砜、1,4-二氧六環(huán)、甲醇、乙腈、乙醇、丙醇、四氫呋喃等,于恒溫水浴振蕩反應(yīng),160次/min;不溶性有機溶劑如乙酸乙酯、丁醇、戊醇、己醇、苯、甲苯、環(huán)己烷、十二醇等,水浴攪拌器攪拌反應(yīng),250r/min)后,加入1.0mL200g/L三氯乙酸溶液終止酶反應(yīng)。過濾,取其上清液于波長275nm處測定消光值。以不含相應(yīng)有機溶劑的0.1mol/LpH7.2磷酸緩沖液為對照(CK)。每項試驗設(shè)3個重復(fù),測定2次取平均值,下同。以37℃下,PA水解酪蛋白時每min產(chǎn)生1μg酪氨酸的酶量定義為1個酶活性單位(U),下同。海藻酸鈉-殼聚糖固定化木瓜蛋白酶(Immobilizedpapainonsodiumalginate-chitosan,IPSAC)的制備參考鄭婉玲等取1gIPSAC,加入0.25mL激活劑(0.1mol/LpH7.2Tris-鹽酸緩沖液,內(nèi)含36mmol/L半胱氨酸和0.6mmol/LEDTA)和2.5mL有機溶液,用0.1mol/LpH7.2Tris-鹽酸緩沖液進(jìn)行配制,使反應(yīng)體系的有機溶劑體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)到5%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,50%,60%和70%,于37℃下預(yù)熱10min,加入37℃預(yù)熱的10g/L酪蛋白溶液0.5mL,準(zhǔn)確反應(yīng)10min(對可溶性有機溶劑,如二甲基亞砜、1,4-二氧六環(huán)、甲醇、乙腈、乙醇、丙醇、四氫呋喃等,恒溫水浴160次/min振蕩反應(yīng);不溶性有機溶劑,如乙酸乙酯、丁醇、戊醇、己醇、苯、甲苯、環(huán)己烷、十二醇等,水浴攪拌器攪拌反應(yīng),250r/min),然后加入1.0mL200g/L三氯乙酸溶液終止酶反應(yīng)。過濾,取其上清液于波長275nm處測定消光值。以不含相應(yīng)的有機溶劑的Tris-鹽酸緩沖液為對照(CK)。尼龍布固定化木瓜蛋白酶(Immobilizedpapainonnyloncloth,IPN)制備參考徐鳳彩等取一塊固定化木瓜蛋白酶的尼龍布,加入0.25mL激活劑(0.1mol/LpH7.2磷酸緩沖液,內(nèi)含36mmol/L半胱氨酸和0.6mmol/LEDTA)和2.5mL有機溶劑,用0.1mol/LpH7.2磷酸緩沖液配制,使反應(yīng)體系中有機溶劑的體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)到5%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,50%,60%和70%,于37℃下預(yù)熱10min,加入37℃預(yù)熱的10g/L酪蛋白溶液0.5mL,準(zhǔn)確反應(yīng)10min(可溶性有機溶劑,如二甲基亞砜、1,4-二氧六環(huán)、甲醇、乙腈、乙醇、丙醇、四氫呋喃等,恒溫水浴振蕩反應(yīng),160次/min;不溶性有機溶劑,如乙酸乙酯、丁醇、戊醇、己醇、苯、甲苯、環(huán)己烷、十二醇等,水浴攪拌器攪拌反應(yīng),250r/min),然后加入1.0mL200g/L三氯乙酸溶液終止酶反應(yīng)。過濾,取其上清液于波長275nm處測定消光值。以不含相應(yīng)有機溶劑的0.1mol/LpH7.2磷酸緩沖液為對照(CK)。用SAS(statisticanalysissystem)軟件分析酶活性差異顯著性。2結(jié)果與分析2.1亞、1,4-二氧六環(huán)、乙腈在低體積分?jǐn)?shù)的表征中從表1可以看出,二甲基亞砜、1,4-二氧六環(huán)、乙腈在低體積分?jǐn)?shù)(由以上分析可以看出,在log2.2不同體積分?jǐn)?shù)的pa及其ipa活性從表2可以看出,隨著丙醇、四氫呋喃體積分?jǐn)?shù)的逐漸升高,PA及其IPA的活性逐漸降低,且降低幅度加快。對乙酸乙酯而言,在低體積分?jǐn)?shù)時,PA及其IPA活性下降較快,但當(dāng)其體積分?jǐn)?shù)超過30%時,酶活性雖開始升高,但仍低于對照(CK)中的酶活性。隨著丁醇、戊醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸升高,PA及其IPA活性迅速下降。由此可見,當(dāng)有機溶劑疏水參數(shù)為0.28～1.31時,其對PA及其IPA活性有顯著抑制作用。2.3對酶活性的影響由表3可以看出,對有機溶劑己醇而言,在低體積分?jǐn)?shù)時,PA及其IPA活性下降較快,但體積分?jǐn)?shù)超過20%后,酶活性開始升高,但仍低于對照(CK)的酶活性。有機溶劑苯、甲苯、環(huán)己烷、十二醇中的情況與己醇的相似,不同的是超過一定體積分?jǐn)?shù)(由表1～3可以看出,隨體積分?jǐn)?shù)上升,供試的15種有機溶劑對PA和IPA活性的作用趨勢不同,但就每一種有機溶劑而言,其對PA和IPA活性的作用趨勢表現(xiàn)一致。方差分析結(jié)果表明,15種有機溶劑在體積分?jǐn)?shù)不同時,均對PA及其IPA的影響差異極顯著。3不同有機溶劑的體外酶活性固定化酶因具有諸多優(yōu)越性而被廣泛應(yīng)用本研究表明,在低疏水參數(shù)的有機溶劑(log本研究發(fā)現(xiàn),在中疏水參數(shù)(0.28≤log本研究表明,在高疏水參數(shù)(log從表2和表3可以看出,乙酸乙酯、己醇在低體積分?jǐn)?shù)時,PA及其IPA活性下降較快,但當(dāng)其體積分?jǐn)?shù)分別超過30%和20%時,酶活性開始升高,但仍低于對照中的酶活性。二者酶活性升高所需的體積分?jǐn)?shù)有所不同,可能是由于己醇的疏水參數(shù)較乙酸乙酯的高。本試驗研究表明,在所有15種有機溶劑中,同種有機溶劑在不同體積分?jǐn)?shù)下對PA及其IPA活性的作用趨勢是一致的。這說明PA不論是在溶液中,還是被固定化,其活性受這些有機溶劑影響的趨勢是相同的。PA被包埋在海藻酸鈉-殼聚糖(形成IPSAC)中,或通過戊二醛與尼龍布共價健結(jié)合(形成IPN)形成固定化酶,并沒有改變有機溶劑對木瓜蛋白酶影響的趨勢。方差分析表明,體積分?jǐn)?shù)不同的15種有機溶劑對PA及其IPA的影響有