電子煙的基因毒性評價方法

基因毒性指的是，外源性因素可能直接或間接損傷細胞dna，導致突變和致死效應。一般外源性因素，如某些化學物質等可在染色體水平、分子水平和堿基水平上造成基因損傷，從而引起致癌、致畸和致突變等毒性作用1以細菌為受試對象細菌回復突變試驗作為致突變物的早期篩選和研究手段，主要利用營養缺陷型菌株，在選擇培養基上經外源性物質處理后，觀察菌株的回復突變的情況，用來判斷外源性物質的致突變能力，是科研機構和政府公認的測定新化學物質和新藥潛在致突變的檢測方法THORNE等MANOJ等由此可見，電子煙對細菌的基因毒性，與試驗方法中的菌株種類、試驗對象形態和暴露時間有一定的關系，因此在進行評價時，應選取公認的標準菌株TA98、TA100等，結合消費者的實際消費情況，采取氣-瓊脂界面暴露染毒的方法，選擇符合實際的暴露時間，觀察菌株的基因毒性情況，并在此基礎上對電子煙的基因毒性進行初步評價。2外源性物質基因毒性的檢測非臨床安全評價中采取離體細胞進行體外試驗研究廣泛應用于單一化學物質和復雜混合物的毒理學評價，常見的有染色體畸變試驗和微核試驗，均是檢測外源性物質基因毒性的試驗方法。此類試驗方法在電子煙氣溶膠總粒相物的基因毒性評價方面也有著成功的應用2.1檢測細胞的微核試驗和損傷情況微核試驗是檢測染色體或有絲分裂器損傷的一種遺傳毒性試驗方法。無著絲粒的染色體片段或因紡錘體受損而丟失的整個染色體，在細胞分裂后期仍留在子細胞的胞質內成為微核。通過檢測哺乳動物細胞分裂期間細胞質中微核情況的體外微核試驗，可以檢測電子煙對染色體的損傷情況。有研究表明參比卷煙3R4F氣溶膠中的總粒相物可導致DNA損傷，進而導致染色體斷裂形成微核，其微核形成率最大的劑量為0.12mg/mL，高于此劑量則會引起細胞的大量死亡。而電子煙氣溶膠總粒相物濃度高達20mg/mL時，仍未觀察到有微核的形成。認為電子氣溶膠總粒相物對細胞遺傳物質DNA的損傷顯著低于參比卷煙2.2毛細管共濟失調突變基因DNA的損傷有很多不同形式，如堿基修飾、DNA單鏈斷裂、DNA鏈內和鏈間交聯以及DNA雙鏈斷裂等，其中DNA雙鏈斷裂被認為DNA最嚴重的損傷。細胞在DNA雙鏈斷裂發生后，產生一系列的應激反應，其中一個主要的反應就是毛細血管共濟失調突變基因（AtaxiaTelangiectasiaMutated,ATM）起始的信號級聯反應，它可以使細胞周期停頓直到損傷修復。而H2AX是這一信號級聯反應中的一個主要成員，它能被ATM磷酸化（稱為γH2AX或gammaH2AX），并在隨后的損傷修復過程中發揮著重要的作用對離體細胞中RNA轉錄組進行測序，以判斷基因表達量的變化，最近也應用于電子煙氣溶膠的基因毒性研究2.3電子煙氣溶膠提取物對血管內皮損傷的影響電子煙的基因毒性研究除選取常用的呼吸系統組織上皮細胞作為受試對象外，也可選取其他細胞系作為受試對象。如研究發現牙齦上皮細胞在暴露電子煙氣溶膠3d后，其形態和乳酸脫氫酶的活性發生變化，基因caspase-3的表達顯著性增加，并與牙齦上皮細胞凋亡存在一定的關聯在低濃度（25μmol/L）情況下，卷煙氣溶膠提取物會造成血管內皮細胞DNA損傷，電子煙氣溶膠提取物未發現相關毒性。該損傷一般由自由基的產生所引起，最終會影響內皮細胞的活性對人肺成纖維細胞(HFL-1)的研究發現，與空氣對照組相比，在電子煙氣溶膠暴露10～20min后，會導致細胞線粒體內的活性氧（ROS）增加，降低細胞核DNA片段的穩定性，同時細胞炎癥因子IL-8和IL-6的水平上升，這可能引起一系列的炎癥產生關于非遺傳致癌毒性，Bhas細胞轉化試驗是一種非常有效的檢測方法。Bhas42細胞是將v-Ha-ras基因導入Balb/c3T3細胞中而建成的細胞系，已處于啟動狀態，在非遺傳毒性致癌物暴露影響下不經過啟動劑的預處理便可引起細胞惡性轉化。H從上述研究來看，通過對微核試驗、RNA轉錄組測序和特定基因的檢測等試驗方法，可以檢測電子煙的相關基因毒性3p450代謝酶由于離體細胞或組織不能模擬人體內部各個系統相互作用的復雜過程，更無法預測電子煙氣溶膠對人體內部的各個器官產生的基因毒性作用，因此一般將體內毒性試驗作為電子煙基因毒性研究的標準方法在呼吸系統方面，有研究表明長期暴露電子煙氣溶膠后，發現肺部致癌相關的P450代謝酶系CYP1A1/2、CYP2B1/2、2C11和CYP3A等代謝酶的數量顯著增加，活性氧（ROS）水平也顯著增加。同時還發現血液樣品中存在較高的微核率，尿液中的DNA出現點突變等遺傳毒性在中樞神經系統發育毒性方面，發現仔鼠腦部前額組織有109個基因表達存在顯著性差異（p<0.01），這些基因表達的差異與后續神經系統發育毒性具有一定的相關性綜上所述，通過模式動物整體暴露試驗，可以評價電子煙氣溶膠對動物體內不同系統的基因毒性大小，但由于模式動物和人類存在暴露方式差異，應考慮與人類吸食電子煙類似的方式進行暴露，選取可靠公認的基因毒性指標，觀察模式動物的時效和量效效應，以獲得準確可比的電子煙基因毒性試驗數據。4ath的定義2011—2014年間，美國食品藥品監督管理局發起了一項煙草與公眾健康評估研究（PATH,PopulationAssessmentofTobaccoandHealth）。通過對32320名國民調查研究發現，當前使用電子煙的主要原因是消費者認為電子煙比傳統卷煙對身體健康的危害小，如由于基因毒性引起的致癌等疾病可能性較低5基因基因突變試驗一般而言，電子煙基因毒性的研究層次包括體外試驗、體內試驗、人體試驗和流行病學研究，研究結果的權重由小到大，且各有優缺點（表1）。常見試驗方法有AMES試驗、哺乳動物細胞基因突變試驗（TK試驗）、染色體畸變試驗、微核試驗、顯性致死試驗、程序外DNA合成試驗、姐妹染色單體交換試驗、單細胞凝膠電泳試驗和轉基因動物致突變試驗等。電子煙的基因毒性產生的原因較多，除電子煙中尼古丁本身