蛹蟲草不同菌株生物學特性及栽培試驗

蠕蟲虱子。1材料和方法1.1材料表面1.1.1試驗中的蘑菇1.1.2培養基(1)PDA加富培養基:馬鈴薯200g,葡萄糖20g,蛋白胨3g,KH1.2方法1.2.1種子平板的制備將野生蟲草子座用清水洗去表面浮土,置于75%乙醇中表面消毒2min,在無菌水中反復沖洗,放在無菌培養皿內備用。用無菌解剖刀將消毒后的蟲草子座切成長度約1cm的小段,接種于PDA培養基的平板上。將接種后的平板放置在22~25℃的培養室中培養。平板略微傾斜放置。48~72h后菌絲萌發,選擇無污染的菌絲,轉接到新的PDA平板上進一步分離,最終得到純化的蟲草菌株。1.2.2社會學觀察1.2.3培養基培養處理工藝將5個供試菌種分別接種于PDA培養基斜面上,22~25℃培養7~10d,待菌絲長滿斜面。將活化后的斜面母種接入含有50mL液體培養基的三角瓶中,22~25℃震蕩培養3~4d,菌絲長滿液體表面。靜置24h確保無雜菌后,轉入500mL營養液中。將30g小麥和50mL自來水裝入罐頭瓶后用耐高溫塑料膜扎緊,100℃常壓滅菌8h,過夜冷卻。取5mL液體菌種,以無菌操作接入瓶內小麥培養基上,18℃黑暗條件下培養7d。此階段主要注意避光和低溫。待菌絲長滿培養基后,22℃光照轉色。轉色7d后在塑料膜上打孔1.2.4對分子的鑒定和系統發育的研究1.2.4.不同溫度下ctab緩沖液的穩定性測定采用CTAB法取適量子實體樣品置于研缽中,液氮冷凍研磨至粉末狀。將樣品粉末轉移到含4mLCTAB緩沖液的滅菌離心管中,65℃下溫育40min,每隔10min顛倒幾次,使樣品混勻。在通風櫥內,加入4mL氯仿∶異戊醇(24∶1),輕微震蕩混合20min。4℃離心10000r·min1.2.4.pcr反應u200450μLPCR擴增反應體系為:模板DNA1μL、10×PCRbuffer5μL、TaqDNA聚合酶0.8μL、dNTP(2.5mM)4μL、ITS4、ITS5(20μM)引物各1μL,用去離子水補至50μL。反應程序為:95℃預變性5min后,進入循環,94℃變性1min、50℃退火1min、72℃延伸1min,共40個循環,于72℃延伸10min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠,1×TAE為電泳緩沖液,5V·cm1.2.4.系統發育樹的構建將所擴增出的5個供試菌株的ITS序列提交到GenBank核酸序列數據庫,與Genbank中已經登錄的序列進行Blastn比對,下載Score分值高的9株最相似菌株的ITS序列與供試菌株的序列進行系統發育樹的構建。用ClustalX軟件處理分析5個供試菌株的ITS序列,再用DNASTAR軟件構建系統進化樹,根據系統發育樹探討其親緣關系。2結果與分析2.1不同菌株的氣生引導基由圖1可見,菌絲長滿整個平板時,白化變異型菌株KB29的菌落顏色為純白色,回復突變菌株KH29菌株為淡黃色;而其余3個菌株均為橘黃色。白化變異型菌株KB29和其回復突變菌株KH29的氣生菌絲較為發達,基內菌絲相對較弱(表1)。5個供試菌株在固體培養基中的生長速度由快至慢依次為KB29、K17、KH29、K19和A2菌株,其中A2菌株需要約24d才能長滿整個平板。2.2各菌株的生長特性由表2可見,K17菌株子實體長,粗細均勻,顏色橘黃,子囊殼豐富,出草整齊,每瓶干重達到4.67g,經濟性狀要明顯優于其他4個供試菌株。其余依次為A2、K19、KH29和KB29菌株;A2菌株的干重雖然也達到4.66g,但子實體不光滑且扭曲,嚴重影響其外觀性狀;白化變異型菌株KB29的菌種活力有所退化,栽培產量較少,且子實體形態變異嚴重;回復突變菌株KH29子實體子囊頭大,有毛刺,但子實體部分較細,不整齊,出草有橘黃色,也有少量白色;K19菌株顏色橘黃,子囊頭也較大,出草整齊但子實體較細(圖2)。2.3整株菌株的現實測序結果由圖3可見,5個供試菌株的ITS擴增片段清晰,大小在500~750bp之間,且擴增結果穩定,重復性好,可以進行系統發育學研究。ITS序列測定結果表明(表3),5個菌株的ITS序列長度為545~566bp,GC含量為56.11%~57.06%。將所擴增出的5個供試菌株的ITS序列與Genbank中已經登錄的序列進行Blastn比對,結果顯示5株菌的ITS序列都為蛹蟲草序列,同源性高達99%。該結果也說明,不同的蛹蟲草菌株間的ITS序列是相對保守的。2.4供試菌株的遺傳穩定性根據BLAST檢索結果,下載Score分值高的9株最相似菌株的ITS序列與供試菌株的序列進行系統發育樹的構建,由圖4可見,14株菌聚成兩個大簇,而供試的5個菌株均與蛹蟲草聚在一起,支持了前面根據Blastn結果和ClustalX分析的初步鑒定結果。5個供試菌株的分類地位同屬蛹蟲草,它們的ITS序列的差異很小,屬于種內差異。野生菌株A2、K19和K17與GU390585等3株蛹蟲草的遺傳距離要小于白化變異型菌株KB29和回復突變菌株KH29,這說明蛹蟲草菌株產生白化變異后,菌株內的遺傳物質發生變化。白化變異型菌株KB29與其他菌株的遺傳距離相對較遠,但與其回復突變菌株KH29遺傳距離相對較小。這是否與其失去合成橘黃色色素的相關基因有關,還有待進一步研究。菌落、菌絲形態和產子實體能力相近并且都具備橘黃色或黃色色素的A2、K19和K17菌株,遺傳距離也相對較小。遺傳距離最為小的為A2和K17菌株。3系統發育學研究供試的5個蟲草菌株,其中包括3個野生菌株A2、K17和K19,一個白化變異型菌株KB29和一個回復突變菌株KH29,它們在生物學特性上有一定差異。在栽培試驗中,K17菌株的子實體性狀最好,每瓶干重可達4.67g,是供試的5個菌株中最適宜人工栽培和開發的菌種。通過ITS序列測定和比對,5個菌株同屬蛹蟲草,且ITS序列遺傳物質差異較小,屬于種內差異。但不同菌株之間ITS序列的差異也有一定規律可循。通過系統發育樹可以看出,ITS序列中遺傳物質的差異和菌落、菌絲和子實體形態之間有正相關性,這符合了基因型決定表現型的遺傳規律。在蛹蟲草人工栽培生產中存在的主要問題就是菌種退化現象嚴重。菌種的退化問題在菌類栽培中普遍存在,而關于蛹蟲草菌種退化有關的生理生化和遺傳機制至今尚無明確的結論。由于ITS序列相對保守,適用于屬內種間或種內群體的系統學研究。由于本研究收集到的5個菌株親緣關系很近,在后續試驗中應考慮采取其他分子生物學方法進行研究。在5個供試菌株中,白化變異型菌株KB29的菌絲體和子實體均為純白色,如果性狀能穩定遺傳,有望在化妝品和保健品領域發揮巨大潛力。野生蟲草菌株K17、K19和A2