課題一微生物試驗室培養專項二微生物培養與應用第1頁微生物11.特點：構造都相稱簡單,個體多數十分微小，一般要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有甚至沒有細胞構造，且體內一般不具有葉綠素，不能進行光合作用。一、基礎知識第2頁酵母菌放線菌第3頁上圖都是某些常見微生物，微生物是構造簡單、形體微小單細胞、多細胞或沒有細胞構造低等生物，與人類關系密切。人工培養和分離，使得我們更深入結識微生物。今天我們就來學習如何培養和分離大腸桿菌！第4頁2.微生物包括五類病毒細菌放線菌真菌原生動物第5頁培養基2培養基（培養液）是由人工辦法配制而成，專供微生物生長繁殖使用混合營養液。第6頁固體培養基液體培養基半固體培養基1.培養基類型成份區分：瓊脂第7頁培養基類型液體培養基：增菌、工業生產固體培養基：純化（分離），判定、活菌計數、保藏菌種半固體培養基：動力檢測第8頁按照培養基用途分選擇培養基鑒別培養基按照培養基成份分合成培養基天然培養基半合成培養基將某種類微生物從混雜微生物群體中分離出來用于鑒別不一樣類型微生物培養基第9頁※幾個選擇培養基①加入青霉素培養基分離酵母菌、霉菌等真菌②不加氮源無氮培養基分離固氮菌③不加含碳有機物無碳培養基分離自養型微生物第10頁2.培養基成份①一般營養物質：水、碳源、氮源、無機鹽、生長因子(即細菌生長必需，而本身不能合成化合物)②滿足其他物質，如對pH、特殊營養物質以及氧氣、二氧化碳、滲入壓等要求第11頁⑴碳源無機碳源：有機碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自養微生物異養微生物⑵氮源無機氮源：有機氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等具有C、H、O、N化合物既能夠作為碳源，又能夠作為氮源，如氨基酸等。基本成份：碳源、氮源、水、無機鹽第12頁配制標準(1)目明確：(2)營養全面、濃度合適、百分比恰當(3)合適pH值：有機碳源異養型：根據微生物種類、培養目標選擇原料自養型：不加有機碳加入緩沖劑細菌偏堿，真菌偏酸（CO2碳源）生產科研微生物生長不可缺乏微量有機物如：維生素、氨基酸、堿基等(4)特殊營養：3.培養基配制第13頁無菌技術3無菌操作泛指在培養微生物操作中，所有避免雜菌污染辦法。無菌操作是培養微生物成功關鍵！避免外來雜菌污染無菌意義：第14頁（1）試驗操作空間、操作者衣著和手，進行清潔和消毒。（2）培養器皿、接種用具和培養基等器具進行滅菌。（3）為避免周圍環境中微生物污染，試驗操作應在酒精燈火焰附近進行。（4）試驗操作時應避免已經滅菌處理材料用具與周圍物品相接觸。1無菌范圍第15頁（1）消毒定義：2.消毒與滅菌概念及二者區分（2）滅菌定義：是指殺滅物體表面或內部部分病原微生物（不包括芽孢和孢子）辦法。是指殺滅或清除環境中一切微生物（包括芽胞、孢子）辦法。第16頁3.常用消毒辦法1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線消毒第17頁a.灼燒滅菌；常用于接種環、接種針、試管口等滅菌。4.常用滅菌辦法第18頁b.干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。常用于玻璃器皿和金屬器具。c.高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.常用于培養基、無菌水等滅菌。第19頁制備牛肉膏蛋白胨培養基1倒平板操作2接種大腸桿菌3大腸桿菌分離后保存4二、試驗操作第20頁制備牛肉膏蛋白胨培養基1計算－稱量－溶化－滅菌－倒平板1.計算第21頁2.稱量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱量紙、少許水加熱溶解→取紙→蛋白胨、NaCl→瓊脂、攪拌→補水定容4.調pH、分裝、封口：5.滅菌：6.倒平板：調整PH至偏堿性，加棉塞、包牛皮紙、橡皮筋勒緊。培養基高壓蒸汽滅菌，培養皿干熱滅菌第22頁1.將培養皿放在火焰旁桌面上，右手拿裝有培養基錐形瓶，左手撥出棉塞。12342.右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰。3.用左手將培養皿打開一條稍大于瓶口縫隙，右手將錐形瓶中培養基(約10～20mL)倒入培養皿，左手立即蓋上皿蓋。4.等候平板冷卻凝固（約需5～

10min）。然后，將平板倒過來放置，使皿蓋在下，皿底在上。倒平板操作2第23頁1.培養基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么措施來估計培養基溫度？用手觸摸，剛才不燙手時2.為何需要使錐形瓶瓶口通過火焰？灼燒滅菌，避免瓶口微生物污染思考：第24頁避免皿蓋上水珠落入培養基，造成污染。3.為何將平板倒置？4.在倒平板過程中，不小心將培養基濺在皿蓋與皿底之間部位，這個平板還能用來培養微生物嗎？最佳不要用該培養基培養微生物。第25頁5.怎么確定所倒平板未被雜菌污染？答：無菌檢查：將滅菌培養基放入37℃溫室中培養24～48小時，觀測是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底。第26頁1.平板劃線法：分區劃線法連續劃線法聚集菌群連續劃線稀釋分散單個細胞菌落生長繁殖微生物接種3（1）平板劃線法原理第27頁第28頁（2）平板劃線法步驟：①灼燒接種環；②接種環冷卻后，蘸取帶菌培養物；③在近火焰處，讓帶菌接種環在固體培養基上劃線。第29頁11.線條不重合22-3.從上次末端開始，交叉2~3條線344.最后劃線不能與第一區相連。第30頁（3）平板劃線法注意事項①接種環只蘸一次菌液，但要在培養基不一樣位置連續劃線數次。②劃線首尾不能相接。③劃線后，培養皿倒置培養12~24h。第31頁3個劃線平板1個不劃線平板（反復試驗）（空白對照）（4）培養放入37℃恒溫箱中培養12h～24h第32頁第一步灼燒接種環：避免接種環上也許存在微生物污染培養物；每次劃線前灼燒接種環：為了殺死上次劃線結束后，接種環上殘留菌種；最后劃線結束后仍要灼燒接種環：能及時殺死接種環上殘留菌種，避免細菌污染環境和感染操作者。1.為何在操作第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環嗎？為何？思考：第33頁2.在灼燒接種環之后，為何要等其冷卻后再進行劃線？以免接種環溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后劃線操作時，為何總是從上一次劃線末端開始劃線？劃線后，線條末端細菌數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線末端開始，能使細菌數目伴隨劃線次數增加而逐漸減少，最后能得到由單個細菌繁殖而來菌落。第34頁①菌液梯度稀釋：②涂布平板操作：(1)概念與原理：聚集微生物單個細胞菌液梯度稀釋菌落涂布平板(2)操作：生長繁殖2.稀釋涂布平板法第35頁稀釋涂布平板法①菌液梯度稀釋注意：移液管需要通過滅菌；試管口和移液管離火焰1～2cm處。第36頁②涂布平板操作第37頁各梯度分別涂布3個平板1個不涂布作空白對照稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍放入37℃恒溫箱中培養12h～24h（3）培養第38頁大腸桿菌分離后保存41.臨時保藏：接種到固體斜面培養基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。2.長期保存：甘油冷凍管藏法1ml甘油＋1ml菌液－20℃第39頁（一）培養基制作是否合格假如未接種培養基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養基制備是成功，不然需要重新制備。三、試驗操作成果評價第40頁（二）接種操作是否符合無菌要求假如培養基上生長菌落顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落特點，則說明接種操作是符合要求；假如培養基上出現了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作尚未達成要求，需要分析原因，再次練習。第41頁（三）是否進行了及時細致觀測與統計培養12h與24h后大腸桿菌菌落大小會有顯著不一樣，及時觀測統計同窗會發覺這一點，并能觀測到其他某些細微變化。這一步要求主要是培養學生良好科學態度與習慣。第42頁微生物試驗室培養培養基培養基類型培養基營養物質無菌技術試驗室常用消毒辦法試驗室常用滅菌辦法制備牛肉膏蛋白胨固體培養基計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板純化大腸桿菌平板劃線法稀釋涂布法成果分析與評價課題延伸【課堂小結】第43頁1