血小板濃縮制品血小板作為一種多功能細胞,不僅在血栓形成和止血中發揮作用,而且在血管發生、組織修復和炎癥過程中也扮演著重要的角色[1]。血小板被激活后，可釋放多種生物活性物質，在促進組織愈合方面起重要作用。目前的血小板濃縮制品經過幾代發展主要有以下幾種：富血小板血漿（plateletrichplasma，PRP），富血小板纖維蛋白（plateletrichfibrin，PRF）,濃縮生長因子（CGF，ConcentrateGrowthFactors）。一發展歷史1984年，Assoion[2]等發現了人血漿中提取的富血小板血漿(platelet—richplasma，PRP)中含有多種生長因子，當PRP與氯化鈣以及牛凝血酶混合后，各種生長因子即從血小板中的α顆粒中釋放出來。但是牛凝血酶的使用往往伴隨著凝血因子Ⅴ、Ⅺ抗體的形成，并且存在著威脅生命的凝血紊亂發生的可能性[3]。作為第二代濃縮血小板，富血小板纖維蛋白（PRF）是由Choukroun。PRF是富纖維蛋白凝膠，由患者靜脈中抽取的新鮮血液制作而成，屬于新一代的血小板濃縮物，它制備簡單無需任何生物添加劑的處理。在PRF通過離心分離的制備過程中，血小板被激活同時大量脫顆粒細胞中蘊含的重要的生長因子釋放出來[4]。濃縮生長因子(CGF)是Sacco首先研發的[5]，與PRF一樣，CGF由靜脈血分離制備而成。不過，兩項技術的離心速度有所不同。與PRF不同，CGF技術采用的速度從2400到2700rpm不等，這是為了分離靜脈血中的細胞，因此CGF中富含纖維蛋白凝塊比PRF中的大得多，而且更粘稠，纖維蛋白的含量也更多。二詳細介紹1PRP1.1PRP制取方法及組成結構PRP最早由Assoian于1984年提取制備[2]，是自身靜脈血經梯度離心分層后位于白細胞上方的富含血小板的血漿部分，含有全血中70%以上的血小板，于其中加入凝結劑(常用10%氯化鈣和凝血酶)可形成膠狀物，激活后血小板α顆粒釋放出多種生長因子，如轉化生長因子-β(TGF-β)、骨形成蛋白(BMPs)、血小板衍生生長因子(PDGF)、類胰島素生長因子(IGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)和成纖維細胞生長因子(FGF)等[6-8]。這些生長因子在PRP中濃度很高，根據不同的制作方法，約為體內正常濃度的幾倍甚至幾百倍[9-11]。PRP血漿成分中的纖維素，纖連蛋白及親玻粘連蛋白，可作為生長因子的載體，同時也是一種非常良好的細胞黏附分子。1.2PRP的現狀在過去的20余年間，PRP已經逐漸被應用于臨床，其中包括促進軟組織愈合和促進骨組織再生方面的應用。應用較多的領域主要有整形美容和創傷外科專業等[12，13]。1998年PRP由Marx首次引入口腔醫學領域中，并逐漸成為口腔醫學的研究熱點之一。其中PRP在口腔種植學骨增量方面相關的研究進行的較多，并且得到了多數的肯定。但是，PRP的應用一直爭議不斷，這些爭議集中于其療效的穩定性[14-19]和使用的安全性上。后者的矛盾最為尖銳。此矛盾的產生源于PRP在制備過程中需要加入異種凝血酶和抗凝血制品，這被認為可能導致免疫排斥反應的發生和感染性疾病的傳播。2PRF2.1PRF制取方法及組成結構為了延續PRP的優勢，同時避免爭議，法國科學家Choukroun等于2000年提取制備了新一代自體血液制品Choukroun富血小板纖維蛋白（Choukrounplatelet-richfibrin，Choukroun’sPRF）[20]。Choukroun’sPRF是自身靜脈血經離心分層后位于貧血小板血漿層（Plateletpoorplasma，PPP）與紅細胞碎片層之間的富含血小板的纖維蛋白凝膠。在制備過程中，Choukroun’sPRF的纖維蛋白原發生緩慢的聚合，形成三分子的立體網狀結構，其凝膠組織具有疏松、孔隙大、彈性好，滯留大量血小板及生長因子的特點。傳統的PRP為四分子結構，而PRF經過緩慢自然的聚合，產生的纖維蛋白為三分子立體網狀結構，其凝膠組織較為疏松，孔隙大，彈性高。組織細胞及循環血中的干細胞能更快的長入其中，細胞因子也被大量的滯納，并與纖維蛋白發生化學鍵結合。PRF的纖維蛋白作為一種基質為細胞的附著，遷移以及分化提供了有利的場所[22]。生長因子主要包括轉化生長因子-β（Transforminggrowthfactor-β，TGF-β）、血小板衍生生長因子-AB(platelet-derivedgrowthfactor-AB，PDGF-AB)、類胰島素生長因子-Ⅰ(insulin-likegrowthfactor-Ⅰ，IGF-Ⅰ)等。由于Choukroun’sPRF纖維蛋白原發生緩慢聚，使血小板和生長因子以化學鍵結合于PRF的纖維蛋白原上，利于其充分發揮協同作用[21]。纖維蛋白基質內還含有大量的免疫細胞，可能參與炎癥反應的調節。2.2Choukroun’sPRF促進骨組織再生的機制、機理Choukroun’sPRF作用的發揮有賴于其富含血小板內的α-顆粒脫顆粒后釋放的多種生長因子。生長因子可以誘導成骨細胞遷移、增殖、分化，促進骨愈合。Choukroun’sPRF內還富含散在的免疫細胞，這些免疫細胞可以釋放多種炎癥因子，可能參與炎癥調節，從而減輕周圍軟組織的炎癥反應，同時具有抗感染能力。Dohan等提出Choukroun’sPRF不僅含有大量血小板，而且可以加強機體的防御反應[23]。在制備Choukroun’sPRF過程中，采集的血液中未添加抗凝劑，也未使用凝血酶和氯化鈣誘導血小板活化及纖維蛋白聚合，模擬生理性的凝血過程，發生了類似天然纖維蛋白網形成的緩慢聚合，形成三分子立體網狀結構[24]。這種網狀結構便于營養物質和氧氣彌散至細胞周圍，為成骨細胞的遷移、增殖及分化提供場所；網狀結構還可以為骨愈合提供支架。與PRP相比，Choukroun’sPRF具有更強的成骨能力。LingHe等研究認為Choukroun’sPRF具有逐步釋放生長因子的生物特性，并使其保持較高水平[25]，從而表現更優越的成骨作用。孫潔等研究顯示Choukroun’sPRF內大部分血小板外膜完整，大量α-顆粒完整未破裂，從而證明PRF內大量血小板仍處于未完全激活狀態[26]。同時，DohanDM等研究認為PRF的網狀結構將血小板、生長因子以化學鍵結合[24]。因此，隨著纖維蛋白逐漸溶解，結合的生長因子緩慢釋放，同時結合的血小板被激活后脫顆粒釋放出生長因子，使生長因子持續發揮作用，延長了生長因子的作用時間，加強了成骨效果。還有研究提出，Choukroun’sPRF內的大量免疫細胞也可以使Choukroun’sPRF內釋放的TGF-β和VEGF在實驗過程中始終保持較高水平[27]。上述研究證實Choukroun’sPRF具有良好的成骨能力。2.3PRF促進軟組織愈合影響的作用原理首先，PRF富含的多種生長因子可協同作用，促進Ⅰ型膠原及纖連蛋白的合成，促進基質干細胞的趨化及增殖，刺激成纖維細胞及血管內皮的分化增殖[29]，在組織愈合過程中起重要調控作用。其次，PRF的三維立體網狀結構作為基質，為細胞的附著，遷移以及分化提供了有利的場所[28]，使組織細胞及循環血中的干細胞能更快的長入其中，并且，這狀細胞中純化的同源二聚體糖蛋白。其主要生理作用是：VEGF與受體結合后促進微血管周圍內皮細胞的增殖、遷移，并改變其基因表達；增強血管通透性，促進血漿蛋白的滲出，形成富含纖維素并有利于新血管形成的細胞外基質。在骨折部位存在氧梯度，在低氧狀態下，VEGF表達增高，促進成骨細胞的分化，提高堿性磷酸酶的表達，促進骨折愈合[45]。(5)表皮生長因子(EGF)是一種由53個氨基酸組成的低分子量單鏈多肽，具有多種生物學活性。其中以刺激體內多種類型組織細胞分裂和增殖最為突出。此外，EGF能促進基質合成和沉積。促進纖維組織形成[46]。(6)成纖維細胞生長因子（FGF）對骨再生和發育以及骨折的恢復起重要作用。他們的主要任務是誘導骨再生，而骨再生是骨組織形成過程中最重要的階段。(7)BMPs（bonemorphogeneticproteins）：BMP是一種疏水性酸性多肽，與羥基磷灰石有較高的親和力，在諸多因子中唯一能夠單獨誘導骨組織異位成骨。這種活性蛋白使未分化的間充質細胞化學趨化、聚集、定向分化為成骨細胞，合成膠原促進骨基質形成，形成鈣化的骨組織。目前確定的已有20種BMPs，以BMP-2為中心，構成網絡化自身調節骨髓基質干細胞的誘導成骨分化[47]。除了以上提到的這些生長因子外，CGF中還具有特殊的網架結構。采用Medifuge分相器進行精準的分離處理，通過纖維蛋白原分子(FG)的聚合作用，獲取的纖維蛋白塊可組成三維聚合物網絡，內部纖維交織，均以凝膠狀態單相連接。在聚合過程中，纖維的直徑不斷增長，直至發生相互作用。纖維蛋白為富含彈性的有機纖維蛋白網格，纖維單體間的濃縮是三分子和多分子性的，這種纖薄，柔軟，彈性及可滲透的網狀結構使得骨細胞、紅細胞、白細胞、血小板及抗體易于增殖。CGF纖維蛋白分子結構為三鍵式聯結，呈立體網狀結構，可有效的滯納血小板及各種循環分子（如細胞因子）。3.3小結與展望CGF可以促進血管有效增長，它使原有骨量的維持或重建成為可能，CGF可以加速移植的生物材料的融合與重整，幾乎不會引起任何感染。纖維蛋白能單獨引起血管新生，這一極其重要的特性可以通過纖維蛋白膠的三維結構來解釋，此外還有困在其中的細胞因子的聯合作用，纖維蛋白原和纖維蛋白降解產物促進了中性粒細胞的遷移，增大了其表面上的受體CD11和CD18的容量，使中性粒細胞可以粘附內皮細胞并游出，同時還可以使中性粒細胞粘附到纖維蛋白原上，這些要素還能形成噬菌作用和酶降解過程。纖維基質能對上皮細胞和成纖維細胞起作用，從而引導受傷部位所覆蓋區域的愈合。所有這些因素使我們可以將CGF視作一個纖維蛋白凝結物，它能引起微脈管化，影響上皮細胞在其表面上的遷移。CGF應用于損傷的組織時，通過引導損傷組織的再血管化，免疫調節以及捕獲循環血中的干細胞，最終促進組織愈合再生。在離心作用過程中，尤其是聚合階段，纖維蛋白膠凝塊的發育與生長使鏈結構向各個方向膨脹。這樣，許多細胞成分被阻止，從而起到多種治療作用，例如：血漿和血小板細胞因子起到修復、消炎和止痛（TNF-a）的作用；血小板傳送信號，釋放各種生長因子，其中最重要的是PDGF、TGFβ-1和IGF-1，促進骨再生。因此，我們獲得體積較大、具有極強抵抗力的纖維蛋白膠凝塊，可將其用于牙洞填充物、膜支撐體、自體膜修復、與其他填充材料混合等一系列治療過程。CGF具有促進組織生長和愈合能力，有利于所有再生組織的恢復。由于CGF的特殊結構，使得其具有極強的可模制性，因此在一定程度上可以代替GBR（引導骨再生技術）中的隔膜，但其在組織中的吸收時間以及隔離軟組織向骨缺損區內部生長的確切機制還尚不明確，因此這也將是未來的一個研究方向。另外CGF技術在即刻種植、頜骨囊腫的治療、拔牙位點的保存、促進骨折愈合等領域也有著廣泛的研究前景。參考文獻[1]高峰,王捷熙,韓穎.富血小板血漿應用于創傷修復的研究進展[J].JournalofExperimentalHematology,2009,17(3):840-843.[2]DohanDM,ChoukrounJ,DissA,etal.Platelet-richfibrin(PRF):asecond-generationplateletconcentrate.PartII:platelet-relatedbiologicfeatures[J].OralSurgOralMedOralPatholOralRadiolEndod,2006,101(3):e45-50.[3]DohanDM,ChoukrounJ,DissA,etal.Platelet-richfibrin(PRF):asecond-generationplateletconcentrate.PartIII:leucocyt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