第四章植物組織與細胞培養1植物組織與器官培養2植物細胞培養3植物原生質體培養1植物組織與器官培養1.1概述1.2植物組織培養的基本步驟1.3愈傷組織培養1.4植物器官培養1.5植物組織培養的應用1.6人工種子1.7植物組織與器官的生物反應器培養1.8植物組織與器官培養存在問題1.1.1植物組織培養植物組織培養是指在無菌條件下，將離體的植物器官、組織、細胞（體細胞、生殖細胞等）、胚胎、原生質體等培養在人工配置的培養基上，給予適當的培養條件，誘發產生愈傷組織、潛伏芽，或者長成新的完整植株的一種實驗技術。也被稱為植物離體培養或試管培養，由此培育的植物也可稱之為“試管植物”。1.1概述試管玫瑰、手指玫瑰組織培養與細胞培養的區別：組織培養是指從機體內取出組織或細胞，模擬機體內生理條件，在體外進行培養使之生存或生長成組織。主要指用于植物快繁的組培技術。細胞培養是指植物細胞在體外條件下的存活或生產，此時細胞不再形成組織。主要是以生產次生代謝產物為目的的大規模細胞培養技術。組織培養分類：根據外植體的不同，組織培養可分為植株培養、器官培養（如植物的根、莖、葉、花藥、子房、胚珠、胚等）、組織培養（含愈傷組織）等。根據培養的操作方式不同，組織培養又可分為固體培養和液體培養。液體培養又可分為振蕩培養、旋轉培養和靜止培養等。全能細胞是能夠表達生物體基因組的任何一種基因，并能分化出該生物體內任何一種類型的細胞，進而發育為一個完全相同的生物體。外植體是指植物組織培養中用來進行離體無菌培養的離體材料，可以是器官、組織、細胞和原生質體等。1.1.2幾個重要概念愈傷組織愈傷組織是由外植體組織增生的細胞產生的一團不定型的疏散排列的薄壁細胞。細胞大小、形狀、液泡化程度、胞質含量、細胞壁特性等具有很大的差異。愈傷組織細胞是分化的，但還沒有形成組織上的結構，因此愈傷組織培養過程中沒有明顯的組織或器官上的分化。愈傷組織可以長期保存，也可以迅速增殖用作無性系；也可以用作原生質體培養時原生質體的來源。繼代培養是指愈傷組織在培養基上生長一段時間后，營養物枯竭，水分散失，并已經積累了一些代謝產物，此時需要將這些組織轉移到新的培養基上，這種轉移稱為繼代培養或傳代培養。細胞分化和形態建成植物通過細胞或組織培養達到再生目的要經過以下兩個步驟：培養的植物細胞或組織的脫分化，形成愈傷組織。由新形成的愈傷組織形成一些分生細胞團，隨后由其分化成不同的器官原基。1.2植物組織培養的基本過程（1）培養材料的采集從理論上講，植物具有全能性的細胞有三類：受精卵；發育中的分生組織細胞；雌雄配子及單倍體細胞；快繁中，最常用的培養材料是莖尖，通常0.5cm左右。無病毒苗莖尖0.1mm以下。（2）

培養材料的消毒自來水—蒸餾水—無菌紗布或吸水紙—消毒刀片切成小塊。無菌環境，70％灑精中浸泡30-60s。漂白粉飽和液或0.01％升汞(HgCI2)水中消毒l0min。取出后用無菌水沖洗3-4次。（3）

制備外植體在無菌的環境下，將已消毒的材料用無菌刀、剪、鑷等，剝去芽的鱗片、嫩枝的外皮或種皮胚乳（葉片則不需剝皮）。然后切成0.2—0.5cm厚的小片。嚴禁用手觸摸材料。（4）

接種和培養接種：將切好的外植體立即接種在培養基上，4-10個/瓶。封口：瓶、管用無菌藥棉或蓋封口，培養皿用無菌膠帶。溫度：25℃左右，因花卉種類及材料部位的不同區別對待。增殖：在新梢等形成后需要繼代培養。把材料分株或切段轉入增殖培養基中，增殖1個月左右后，可視情況繼代。（5）根的誘導繼代培養形成的不定芽和側芽一般沒有根，必須轉到生根培養基上進行生根。培養1個月后即可獲得健壯根系。（6）

組培苗的練苗移栽培養容器打開，室內3天，取出小苗，用自來水沖洗根系上的營養基，栽入基質。移栽前要適當遮蔭，加強水分管理，保持較高的空氣濕度。1.3.1愈傷組織培養的基本過程1.3.2愈傷組織培養的應用舉例1.3愈傷組織培養（1）愈傷組織的形成啟動期（或誘導期）：主要是指細胞或原生質體準備分裂的時期。誘導劑如NAA,IAA,2,4一D等或細胞分裂素。分裂期：即開始分裂并不斷增生子細胞的過程。分化期：細胞內部開始發生一系列形態和生理上的變化，分化出形態和功能不同的細胞。1.3.1愈傷組織培養的基本過程（2）愈傷組織的生長（3）愈傷組織的分化和形態的發生自身條件（如遺傳性狀、來源部位、年齡等等）、培養基（如是固體還是液體、生長素、激動素、其他營養等）培養條件（如溫度、光質與光照強度、光周期、通氣量）蘆薈組織培養快速繁殖（1）材料和培養基：蘆薈幼苗，10-15cm高；愈傷誘導培養基：MS+(1-6mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA；分化培養基：MS+(2-4mg/L)BA＋(0.1-0.5mg/L)NAA；生根培養基：MS＋(0.1-0.5mg/L)IBA十2-5mg/L）PP333。1.3.2愈傷組織培養的應用舉例（2）愈傷組織培養：清水沖洗，取莖尖部分，再沖洗1-2次，淋干。超凈臺上，75％的乙醇浸泡30-60s，升汞浸5-10min，無菌水沖洗數次。用解剖刀取出包括莖尖生長點的組織切塊，接種到愈傷組織誘導培養基上。培養條件：每天光照10-12h，光照度為1000～20001x,溫度25士2℃。15-25天后，試管中外植體膨大，形成愈傷組織。1周后將愈傷組織轉管進行繼代培養或分化培養。（3）繼代培養：取出愈傷組織，剔除附著在愈傷塊上的培養基，無菌水反復清洗數次愈傷塊上無殘留培養基。用解剖刀將愈傷塊切成數個小塊，再接種到裝有愈傷組織誘導培養基的三角瓶中，在與誘導愈傷組織相同的培養條件下繼續培養。幾天后，三角瓶中的小愈傷塊即可逐漸長大。（4）分化培養：將愈傷組織取出，用無菌水洗凈，切成小接種塊接種到裝有分化培養基的三角瓶中，環境條件同愈傷組織培養。30-50天后，愈傷組織分化出芽并繼續長出小葉片。（5）生根培養：當三角瓶中的幼苗葉片長到3cm左右時，將幼苗取出，放入裝有生根培養基的三角瓶中培養。半個月后，幼苗生根。（6）煉苗：幼苗根長到一定長度，形體已顯健壯時，取出并在清水中洗除附著在根上的培養基。將洗凈的幼苗排好，用清水噴濕，在15～250C,濕度60％～80％的條件下煉苗24h，也可視情況縮短為12h。（7）移栽：煉苗后，將幼苗移栽人由蛭石組成的馴化苗圃中馴化，每天定期給幼苗噴施馴化培養液和清水，大約15一20天后（視幼苗長勢）即可移栽到苗圃中。注意事項精確稱取試劑。蔗糖-白糖。121℃,30min。對接種室進行甲醛熏蒸和紫外線滅菌。培養過程中出現雜菌污染，應立即將該污染試管或三角瓶中的培養物倒掉并將試管或三角瓶洗凈，烘干備用。煉苗后也可先將試管苗浸泡在有生根粉清水中1一2h，再移栽到馴化苗圃中。馴化過程中，除要注意環境濕度、溫度和光照外，還要注意防止各種病蟲害的發生。紅蜘蛛和蚜蟲，可噴施40％的氧化樂果乳油1200倍液。黑斑病，噴施50％多菌靈可濕性粉劑1000倍液。海帶愈傷組織培養海藻是一類生長于海洋的低等植物。多含有人類需要的生理活性物質，因此大多具有重要的經濟價值。傳統的海藻養殖多采用天然水域的人工養殖或人工捕撈手段，但是易受季節、氣候、污染、地域等條件限制。因此，開展相關海藻人工組織培養具有重要意義。海藻組織培養最早可以追溯到20世紀50年代。我國在20世紀80年代開始藻體離體培養的研究，到了20世紀90年代，海帶、紫菜、石花菜、裙帶菜等一些海藻的組織培養已獲得了實際應用。藻體為褐色，帶狀，有光澤，長達2～3米，基部有固著用的假根。海帶產于太平洋沿岸，我國遼寧、山東沿海都有分布。藻體可供食用或藥用，是制碘工業的原料。

（1）選擇合適的培養用外植體：海帶的藻體分為葉片、柄、假根三部分，葉狀體下部細胞分裂旺盛，具有較高的形成愈傷組織的能力，因此一般選用這部分切塊后作為組織培養用的外植體。（2）無菌處理：將切割獲得的外植體洗干凈后用酒精消毒處理。（3）愈傷組織誘導培養：前面步驟獲得的外植體放人培養器中培養。培養愈傷組織和保存無性系－固體培養基，擴培和使愈傷組織分化－液體培養基。海藻培養用培養基主要成分－海水。激素。1.4.1概念1.4.2植物器官培養的應用舉例1.4植物器官培養植物器官培養是指將植株上的各種器官從母體上分離出來，放在無菌的人工環境中讓其進一步發育，最終長成幼苗的過程。器官培養不僅是研究器官生長、營養代謝、生理生化、組織分化和形態形成等的很好方法在生產實際中也具有重要的應用價值。快速建立試管苗，實現名、特、優等珍貴品種快速繁殖；利用莖尖培養可以得到脫毒植株，解決馬鈴薯、甘蔗、大蒜、草萄、康乃馨等品種的退化問題；將植物器官做誘變處理，得到突變株，進行突變育種等。1.4.1概念以馬鈴薯莖尖脫毒培養為例，簡單介紹植物器官培養的應用。1.4.2植物器官培養的應用舉例圖1-1脫（無）毒試管苗生產程序試管苗繁殖

試管苗切斷到試管薯繁殖過程試管薯和微型薯比較(Atlantic和Favorita）不同光周期下形成的試管薯克新1號（0，8，12，16h）荷蘭無花（0，8，12，16h）圖4-2不同濃度IAA與GA（A）、GA+BAP（B）互作對試管苗生長及試管薯形成的影響

Fig.4-2DetailsoftheinteractionofvariousIAAconcentrationswithGA3（A）andGA3+BAP

（B）onthegrowthandmicrotuberizationofpotatoexplants.

不同濃度茉莉酸對試管苗生長影響Favorita（0，0.2，2，20，50mg/L）荷蘭無花（0，0.2，2，20，50mg/L）茉莉酸通氣條件和硝酸銀對試管苗的影響

（從左向右：密封，密封＋硝酸銀，通氣，通氣+硝酸銀）Favorita；蘭芽硝酸銀鹽脅迫下試管苗的生長020406080mM020406080mM1.5.1無性系快速繁殖技術1.5.2獲得無病毒植株1.5.3新品種選育1.5.4在遺傳、生理生化和病理等研究上的應用1.5.5種質資源的保存1.5.6產業化生產前景1.5植物組織培養的應用由于試管繁殖周期短、繁殖系數高、不受季節限制，便于工廠化生產，20世紀80年代初，在世界范圍內，植物組織、細胞培養形成了一個新興的產業，如美國的蘭花試管苗，荷蘭的花卉試管苗等。我國20世紀80年代初，投資完成了第一個甘蔗試管苗工廠。近年來，兩廣在試管繁殖香蕉方面也實現產業化，并出口國外，獲得較好經濟效益。1.5.1無性系快速繁殖技術農作物如馬鈴薯、甘草、草莓,大蒜等。花卉，如康乃馨、菊花、郁金香、水仙、百合等不能通過種子途徑去除病毒。對于花卉而言會影響花卉的觀賞效果，對于經濟作物也會影響產量。如：病毒常使馬鈴薯減產50%左右；蘋果減產14％～45%，而且品質惡化、口感變差、不易儲藏。1.5.2獲得無病毒植株突變育種利用培養的細胞誘發和篩選突變體有很多優點：首先，通過植物組織或細胞培養可以獲得大量的可供選擇的各種變異的群體，這些群體的生長容易控制。在很短時間內完成突變體的篩選。在培養的細胞中選擇突變體有利于在分子水平上研究突變機制。1.5.3新品種選育不足之處是：在細胞水平上篩選的突變不一定都能在植株水平上表達。染色體不太穩定，再生能力容易喪失。除原生質體外，很難獲得完全單細胞的材料。與微生物相比，植物細胞群體增殖時間較長，細胞易積聚在一起。原生質體融合和細胞雜交利用原生質體培養系統分離和鑒定各種突變體使通過單細胞的誘變和篩選突變體成為可能。懸浮培養的原生質體是比較均一的，可以在十分一致的條件下用誘變劑處理。并且還能以單細胞單位進行分離。可以克服遠源有性雜交中的不親和性，提供新的核質組合，從而獲得新物種。不足之處是：在細胞水平上篩選的突變不一定都能在植株水平上表達。染色體不太穩定，再生能力容易喪失。除原生質體外，很難獲得完全單細胞的材料。與微生物相比，植物細胞群體增殖時間較長，細胞易積聚在一起。花藥、花粉培養與單倍體植株組成花藥的細胞有兩種：一是體細胞，包括花藥壁和隔組織的細胞；另一種是雄性性細胞，即小孢子。花粉是由花藥內的花粉母細胞發育而來的，壁內含有雄配子。由于花粉的染色體只有體細胞的一半，因此通過花藥培養的植株是單倍性的。單倍體植物沒有顯性基因的掩蓋作用，易于選擇，并能在很短時間內獲得純合二倍體植株，因此在育種實踐中具有獨特的優越性，花藥培養也成為染色體工程遺傳育種的一個有效途徑。組織培養由于能快速、大量地獲得性狀一致的實驗材料，從而大大地推動了植物遺傳、生理生化和病理等領域的研究進程。如植物組織培養有助于了解植物營養問題、進行光合作用理論研究、研究植物的抗病性、觀察染色體的變異等。通過組織培養，可縮短育種年限和世代，也有利于基因突變中隱性突變的分離。1.5.4在遺傳、生理生化等研究上的應用利用植物組培和細胞低溫保存等方法保存種質，可大大節省人力、物力，大大延長保存期。同時也便于種質資源的交換和轉移，防止病害。例如：胡蘿卜和煙草等植物細胞胞培養懸浮物可在－20℃～－196℃的低溫保存數月，而且還能恢復生長，再生成為植株。1.5.5種質資源的保存花卉種苗產業化生產在花卉生產方面，種苗質量在栽培效果中的重要性占50%以上。蔬菜、水果種苗脫毒馬鈴薯、食用百合、大蒜等蔬菜品種組培脫毒技術就可迅速恢復品種種性，提高生產力。瓜果組培苗產業化生產草莓易感染各種病毒病，感病果實畸形，品質差，一般減產30％～80%。對草酶進行熱處理——分生組織培養脫毒，去病毒苗品質好。1.5.6產業化生產前景1.6.1概念1.6.2優勢1.6.3制作流程1.6.4包埋介質條件及包埋方法1.6人工種子人工種子就是最外面包裹一層有機薄膜的植物胚狀體。由人工種皮、人工胚乳和繁殖體組成。外層膠囊狀的固定化膜保護胚狀體中的水分并能防止外部力量沖擊，中間含有培養物所需的營養成分和某些植物激素，最內則是被包裹的胚狀體或芽。1.6.1概念采用人工種子進行快速繁殖便于運輸和儲藏。人工胚乳中可加入植物激素、有益微生物或抗病、抗蟲成分等，優于天然種子，生產效率更高。固定雜種優勢，加速良種繁育。作為植物基因工程和遺傳工程的橋梁。保存珍貴品種。1.6.2采用人工種子的優勢1.6.3人工種子的制作流程選取目標植物從外植體誘導愈傷組織愈傷轉移到液體培養基愈傷在液體培養基中擴增愈傷轉移到無激素培養基體細胞胚包裹人工種皮溫室播種獲得目標植物對于人工胚乳，理想的包埋介質應該滿足：對所要包埋的材料無傷害。有足夠柔軟性，可保護繁殖體，并允許其發育。具有一定硬度，避免運輸、操作過程中的傷害。具有穿透性，傳遞細胞生長所需的營養；并能容納其他附加成分，如防腐劑、殺蟲劑等。利于用現有的溫室或農機機械進行播種。1.6.4人工種子的包埋海藻酸鹽作為人工種子的包埋劑優點：它具有成膠容易、操作條件溫和、使用方便、毒性極低、成本低廉等優點。缺點：水性營養成分易流失、表面易結團等。人工種子的包埋方法主要有以下四種復合凝聚：指兩種帶相反電荷的電解質在水中相互作用形成多聚體包被溶液。界面聚合：在兩相界面處因溶解度低而成膜。離子交換凝膠：經過離子交換而形成絡合物成為凝膠。代表物質為海藻酸鹽包埋。變溫凝膠：高溫下為液體，低溫下為固體凝膠。因此可用各種模具塑造不同形狀的膠塊。1.7.1特點分析1.7.2生物反應器1.7植物組織與器官的生物反應器培養1.7.1特點分析毛狀根培養由于毛狀根呈現多分支狀態，易結團，因此會對反應