離子交換層析原理離子交換層析原理離子交換層析原理1848年，Thompson等人在研究土壤堿性物質交換過程中發現離子交換現象。本世紀40年代，出現了具有穩定交換特性的聚苯乙烯離子交換樹脂。50年代，離子交換層析進入生物化學領域，應用于氨基酸的分析。目前離子交換層析仍是生物化學領域中常用的一種層析方法，廣泛的應用于各種生化物質如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。

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1848年，Thompson等人在研究土壤堿性物質交換過程中發現離子交換現象。本世紀40年代，出現了具有穩定交換特性的聚苯乙烯離子交換樹脂。50年代，離子交換層析進入生物化學領域，應用于氨基酸的分析。目前離子交換層析仍是生物化學領域中常用的一種層析方法，廣泛的應用于各種生化物質如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。

2020/11/262第一節基本原理

在水中呈不溶解狀態，能釋放出反離子。同時它與溶液中的其他離子或離子化合物相互結合，結合后不改變本身和被結合離子或離子化合物的理化性質。離子交換劑特性2020/11/263

離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應主要是以離子交換方式進行。所進行的離子交換反應是可逆的。假定以RA代表陽離子交換劑，在溶液中解離出來的陽離子A+與溶液中的陽離子B+可發生可逆的交換反應，反應式為：RA+B+

→RB+A+該反應能以極快的速率達到平衡，平衡的移動遵循質量作用定律。離子交換反應2020/11/264示意圖（離子交換過程）電離基團（磺酸根）可交換離子（鈉離子）交換離子不交換離子2020/11/265離子交換劑對溶液中不同離子具有不同的結合力，結合力的大小取決于離子交換劑的選擇性。離子交換劑的選擇性可用其反應的平衡常數K表示：K＝[RB][A+]/[RA][B+]如果反應溶液中[A+]等于[B+]，則K＝[RB]/[RA]。若K>1，即[RB]>[RA]，表示離子交換劑對B+的結合力大于A+；若K=1，即[RB]＝[RA]，表示離子交換劑對A+和B+的結合力相同；若K<1，即[RB]<[RA]，表示離子交換劑對B+的結合力小于A+。K值是反映離子交換劑對不同離子的結合力或選擇性參數，故稱K值為離子交換劑對A+和B+的選擇系數。2020/11/266影響離子交換選擇性的因素水合離子半徑：半徑越小，親和力越大；離子化合價：高價離子易于被吸附；溶液pH：影響交換基團和交換離子的解離程度，不但影響交換容量；對交換選擇性影響亦大。離子強度：越低越好；有機溶劑：不利于吸附；交聯度、膨脹度、分子篩：交聯度大，膨脹度小，篩分能力增大；交聯度小，膨脹度大，吸附量減少；樹脂與粒子間的輔助力：除靜電力以外，還有氫鍵和范德華力等輔助力；如Na+<Ca2+<Al3＋<Si4＋。如原子價數相同，交換量則隨交換離子的原子序數的增加而增大，如Li＋<Na＋<K＋<Pb＋。在稀溶液中適用。在稀溶液中，強堿性樹脂的各負電性基團的離子結合力次序是：CH3COO–<F–<OH–<HCOO–<Cl–<Br–<CrO42–<NO2–<I–<C2O42–<SO42–<檸檬酸根。弱堿性陰離子交換樹脂對各負電性基團結合力的次序為：F–<C1–<Br–=I–＝CH3COO–<MoO42–<PO43–<AsO43–<NO3–<酒石酸根<檸檬酸根<CrO42–<SO42–<OH–。1、競爭；2、增加蛋白質的水合作用，降低吸附和交換速度。2020/11/267兩性離子如蛋白質、核苷酸、氨基酸等與離子交換劑的結合力，主要決定于它們的理化性質和特定的條件下呈現的離子狀態。當pH<pI時，能被陽離子交換劑吸附，反之，當pH>pI時，能被陰離子交換劑吸附。若在相同pI條件下，且pI>pH時，pI越高，堿性越強，就越容易被陽離子交換劑吸附。離子交換層析就是利用離子交換劑的荷電基團，吸附溶液中相反電荷的離子或離子化合物，被吸附的物質隨后為帶同類型電荷的其他離子所置換而被洗脫。由于各種離子或離子化合物對交換劑的結合力不同，因而洗脫的速率有快有慢，形成了層析層。2020/11/268離子交換機理A+自溶液中擴散到樹脂表面A+從樹脂表面進入樹脂內部的活性中心A+與RB在活性中心上發生復分解反應解吸附離子B+自樹脂內部擴散至樹脂表面B+離子從樹脂表面擴散到溶液中交換速度的控制步驟是擴散速度，不同的分離體系可能由內部擴散或外部擴散控制2020/11/269影響交換速度的因素顆粒大小：愈小越快交聯度：交聯度小，交換速度快溫度：越高越快,與擴散系數增加有關離子化合價：化合價越高，擴散速度小離子大小：越小越快攪拌速度：在一定程度上，越大越快溶液濃度：當交換速度為外擴散控制時，濃度越大，交換速度越快2020/11/2610離子交換層析的基本原理

若選擇陽離子交換樹脂，則帶正電荷的物質與H+發生交換而結合在樹脂上。若選擇陰離子交換樹脂，則帶負電荷的物質可與OH-發生交換而結合在樹脂上。物質在樹脂上結合的牢固程度有差異，選用適當的洗脫液可將混合物中的組分逐個洗脫下來，達到分離純化的目的。++++++———++++++++++2020/11/26111.平衡階段:離子交換劑與反離子結合2.吸附階段：樣品與反離子進行交換3、4.解吸附階段：梯度緩沖溶液先洗下弱吸附物質，后洗下強吸附物質5.再生階段：用原始平衡液進行充分洗滌，既可重復使用2020/11/2612第二節離子交換劑的分類及性質

一、離子交換劑的類型根據離子交換劑中基質的組成及性質，可將其分成兩大類：疏水性離子交換劑和親水性離子交換劑。(1)疏水性離子交換劑是一種與水親和力較小的人工合成樹脂，最常見的是由苯乙烯與交聯劑二乙烯苯反應生成的聚合物，在此結構中再以共價鍵引入不同的電荷基團。由于引入電荷基團的性質不同，又可分為陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂及螯合離子交換樹脂。2020/11/2613①陽離子交換劑：

陽離子交換劑的電荷基團帶負電，反離子帶正電，可與溶液中的陽離子或帶正電荷化合物進行交換反應。依據電荷基團的強弱，可分為強酸型(帶磺酸的基團，R－SO3H)、中強酸型（含磷酸基團或亞磷酸基團，R－PO3H2）及弱酸型（帶羧基和酚基的樹脂，R－COOH或R－苯環－OH）三種。這些交換劑在交換時，氫離子為外來的陽離子所取代，如下式所示：R－COOH＋Na+＝R－COONa＋＋H+2020/11/2614②陰離子交換劑此類交換劑是在基質骨架上引入季胺[-N

(CH3)3]、叔胺[-N(CH3)2]、仲胺[-NHCH3]和伯胺[-NH2]基團后構成的。

依據胺基堿性的強弱，又可分為強堿性(含季胺基)、弱堿性(含叔胺、仲胺基)及中強堿性(既含強堿性基團又含弱堿性基團)三種陰離子交換劑。

它們與溶液中的離子進行交換時，反應式為：2020/11/2615③螯合離子交換劑：

這類離子交換樹脂具有吸附(或絡合)一些金屬離子而排斥另一些離子的能力，可通過改變溶液的酸度提高其選擇性。由于它的高選擇性，只需用很短的樹脂柱就可以把欲測的金屬離子濃縮并洗脫下來。疏水性離子交換劑含有大量的活性基團，交換容量大、流速快、機械強度大，主要用于分離無機離子、有機酸、核苷酸及氨基酸等小分子物質，也可用于從蛋白質溶液中除去表面活性劑(如SDS)、去污劑(如TritonX—100)、尿素、兩性電解質等。2020/11/2616(2)親水性離子交換劑

與水親和性較大，有纖維素、交聯葡聚糖、交聯瓊脂糖等。①纖維素離子交換劑又稱離子交換纖維素，是以微晶纖維素為基質，引入電荷基團構成的。分為強酸性、弱酸性、強堿性及弱堿性離子交換劑。纖維素離子交換劑中，最廣泛使用的是二乙胺基乙基(DEAE一)纖維素和羧甲基(CM一)纖維素。近年來Pharmacia公司用微晶纖維素經交聯作用，制成了類似凝膠的珠狀弱堿性離子交換劑(DEAE—Sephacel)，結構與DEAE一纖維素相同，對蛋白質、核酸、激素及其他生物聚合物都有同等的分辨率。2020/11/2617微晶纖維-又稱纖維素膠或結晶纖維素性狀：白色或幾乎白色的細小粉末，無臭，無味，可壓成自身粘合的小片，并可在水中迅速分散，不溶于水、稀酸、稀堿溶液和大多數有機溶劑。制法：將纖維性植物材料與無機酸搗成漿狀，經處理使之降解后漂洗、研磨、脫水、烘干、粉碎制成。2020/11/2618目前常用的纖維素交換劑2020/11/2619離子交換纖維素適用于分離大分子多價電解質。特點：結構疏松，對生物高分子物質(如蛋白質和核酸分子)有較大的穿透性；表面積大，因而有較大的吸附容量；基質是親水性的，避免了疏水性反應對蛋白質分離的干擾；電荷密度較低，與蛋白質分子結合不牢固，在溫和洗脫條件下即可達到分離的目的，不會引起蛋白質的變性。但纖維素分子中只有一小部分羥基被取代，結合在其分子上的解離基團數量不多，故交換容量小，僅為交換樹脂的1/10左右。2020/11/2620

②交聯葡聚糖離子交換劑交聯葡聚糖離子交換劑是以交聯葡聚糖G–25和G–50為基質，通過化學方法引入電荷基團而制成的。交換劑G–50型適用于相對分子質量為3×104～3×106的物質的分離，交換劑G–25型能交換相對分子質量較小(1×103～5×103)的蛋白質。交聯葡聚糖離子交換劑的性質與葡聚糖凝膠相似，在強酸和強堿中不穩定，在pH＝7時可耐120℃的高熱。它既有離子交換作用，又有分子篩性質，可根據分子大小對生物高分子物質進行分級分離，但不適用于分級分離相對分子質量大于2×105的蛋白質。2020/11/2621

③瓊脂糖離子交換劑主要以交聯瓊脂糖CL–6B為基質，引入電荷基團而構成。這種離子交換凝膠對pH及溫度的變化均較穩定，可在pH3～10和0～70℃范圍內使用，改變離子強度或pH時，床體積變化不大。如DEAE–SepharoseCL–6B為陰離子交換劑；CM–SepharoseCL–6B為陽離子交換劑,它們的外形呈珠狀，網孔大，特別適用于相對分子質量大的蛋白質和核酸等化合物的分離，即使加快流速，也不影響分辨率。2020/11/2622按骨架結構不同，離子交換樹脂可分為：凝膠型和大孔型。苯乙烯或丙烯酸與交聯劑二乙烯苯聚合而成，透明，沒有毛細孔，吸水后形成微細的孔隙，適合交換無離子等小分子。苯乙烯或丙烯酸與交聯劑二乙烯苯的異構體聚合，經過特殊的物理處理，行成大網孔，再導入交換基團制成，不透明，既有微孔又有大粗孔，吸附大分子，耐污染。2020/11/2623疏水性離子交換劑（樹脂）的命名

（D）①②③×④（D）——大孔型無——凝膠型①分類代號0—強酸1—弱酸3—弱堿4—螯合5—兩性6—氧化還原活性基團②骨架名稱0—苯乙烯系1—丙烯酸系2—酚醛系3—環氧系4—乙烯吡啶系5—脲醛系6—氯乙烯系③順序代號用以區別交換基團或交聯劑的差異。④交聯度（%）2020/11/2624例：001×7凝膠型苯乙烯系強酸陽離子交換樹脂交聯度為7%

D001大孔強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂

2020/11/2625親水性離子交換劑的命名交換基團寫在前面，然后寫骨架，最后寫原骨架的編號。在編號前加C、A以區分陽離子和陰離子。如：DEAE-SephadexA-25CM-SephadexC-252020/11/2626二、性質1、顏色與形狀樹脂類離子交換劑：褐色、黃色、乳白色等親水性離子交換劑：白色珠狀2、交聯度交聯度：交聯劑在離子交換劑中的比例，用重量百分率表示。2020/11/26273、膨脹度（吸水量）膨脹度：每g干膠在水或其他規定的溶劑中，在一定時間與溫度條件下膨脹后所占有的體積毫升數。影響膨脹度的因素有：（1）、基質（2）、電荷基團（3）、離子強度和pH值

親水性離子交換劑大，疏水性離子交換劑小。與交聯度的關系。強堿和強酸大于弱堿和弱酸；電荷數和性質相同，相差不大。交聯度大的離子交換劑對離子強度和pH值不敏感。交聯度小或者弱的離子交換劑相反。2020/11/2628

4.交換容量交換容量是指離子交換劑能提供交換離子的量，它反映離子交換劑與溶液中離子進行交換的能力。通常以每毫克或每毫升交換劑含有可解離基團的毫克當量數（meq/mg或meq/ml）表示。總交換容量：理論交換容量，它只和離子交換劑本身的性質有關。有效交換容量：實際交換容量，與實驗條件有很大的關系，后面提到的交換容量如未經說明都是指有效交換容量。2020/11/2629

影響交換容量的因素：

1、篩孔要根據被分離的對象來選擇。樣品組分與離子交換劑作用的表面積越大，交換容量越高。一般離子交換劑的孔隙應盡量能夠讓樣品組分進入，這樣樣品組分與離子交換劑作用面積大。分離小分子樣品，可以選擇較小孔隙的交換劑，因為小分子可以自由的進入孔隙，而小孔隙離子交換劑的表面積大于大孔隙的離子交換劑。2020/11/26302、離子強度一般來說，離子強度增大，交換容量下降。實驗中增大離子強度進行洗脫，就是要降低交換容量以將結合在離子交換劑上的樣品組分洗脫下來。3、pH值首先pH值影響樣品中組分和離子交換劑的帶電性質。其次影響離子交換劑的解離程度。pH對弱酸和弱堿型離子交換劑影響較大，弱酸型離子交換劑在pH較高時，電荷基團充分解離，交換容量大，而在較低的pH時，電荷基團不易解離，交換容量小。2020/11/2631交換容量的測定法（1）強酸型陽離子交換介質交換容量的測定法

取一定量的離子交換介質，去離子水溶脹，漂洗干凈用1mol／L的NaOH處理，去離子水洗至中性，1mol／L的HCl處理，去離子水洗至中性。然后用1mol／L的NaCl洗脫，收集洗脫液，再通過已標定的NaOH滴定洗脫液中的氫離子濃度，計算出吸附氫離子的毫摩爾數量，除以離子交換介質的質量，即可得到交換容量。2020/11/2632（2）強堿型陰離子交換介質交換容量的測定方法

取一定量的離子交換介質，去離子水溶脹，漂洗干凈，用1mol／L的HCl處理，去離子水洗至中性，1mol／L的NaOH處理，去離子水洗至中性。然后用1mol／L的NaCl洗脫，收集洗脫液，再通過已標定的HCl滴定洗脫液中的氫氧根離子濃度，計算出吸附氫氧根離子的毫摩爾數量，除以離子交換介質的質量即可得到交換容量。2020/11/2633（3）凝膠或纖維類弱堿性或弱酸性離子交換介質

換容量的測定方法

取一定量的離子交換介質，漂洗干凈，用1mol／L的NaCl處理，去離子水洗至中性，緩沖液平衡，用已知蛋白的濃度樣品過柱吸附，直至柱內的介質吸附的量達到飽和。用一定濃度的NaCl或其他的洗脫劑洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液中的蛋白質的濃度，按計算公式計算交換容量。2020/11/26345．其它穩定性，離子交換劑穩定性都較好，特別是樹脂類離子交換劑，在濃度較高的酸或堿溶液中進行短期處理后，其性質仍無改變。而親水性離子交換劑的理化穩定性一般與其基質的穩定性相近。與樹脂類相比，穩定性差，易被污染。比重，離子交換劑經過溶脹處理后的比重是恒定的。不同的溶液中溶脹處理后的比重是有差異。流速，一般是由離子交換劑的性質、操作壓、層析柱體積和分離樣品的要求等因子控制的。在操作壓和其它層析條件相同的情況下，離子交換劑的顆粒大，洗脫液的黏度小，流速就快，反之流速則慢。2020/11/2635第三節離子交換劑與緩沖液的選擇

一、離子交換劑的選擇應用離子交換層析技術分離物質時，選擇理想的離子交換劑是提高獲得率和分辨率的重要環節。任何一種離子交換劑都不可能適用于所有的樣品物質的分離，因此必須根據各類離子交換劑的性質以及待分離物質的理化性質，選擇一種最理想的離子交換劑進行層析分離。2020/11/2636選擇離子交換劑的一般原則如下：(1)陰、陽離子交換劑選擇如果被分離物質帶正電荷，應選擇陽離子交換劑；如帶負電荷，應選擇陰離子交換劑；如被分離物為兩性離子，則一般應根據其在穩定pH范圍內所帶電荷的性質來選擇交換劑的種類。(2)強、弱離子交換劑選擇強型離子交換劑適用的pH范圍很廣，常用來制備去離子水和分離一些在極端pH溶液中解離且較穩定的物質。弱型離子交換劑適用pH范圍狹窄，在pH為中性的溶液中交換容量高，用它分離生命大分子物質時，其活性不易喪失。

2020/11/2637(3)不同離子型交換劑的選擇離子交換劑處于電中性時常帶有一定的反離子，使用時選擇何種離子交換劑，取決于交換劑對各種反離子的結合力。為了提高交換容量，一般應選擇結合力較小的反離子。據此，強酸型和強堿型離子交換劑應分別選擇H型和OH型；弱酸型和弱堿型交換劑應分別選擇Na型和Cl型。另外還要保證平衡離子不對樣品組分有明顯影響。因為在分離過程中，平衡離子被置換到流動相中，它不能對樣品組分有污染或破壞。如在制備過程中用到的離子交換劑的平衡離子是H或OH離子，因為其它離子都會對純水有污染。但是在分離蛋白質時，一般不能使用H或OH型離子交換劑，因為分離過程中H或OH離子被置換出來都會改變層析柱內pH值，影響分離效果，甚至引起蛋白質的變性。

2020/11/2638(4)不同基質離子交換劑的選擇交換劑的基質是疏水性還是親水性，對被分離物質的穩定性和分離效果均有影響。一般認為，在分離生命大分子物質時，選用親水性基質的交換劑較為合適，它們對被分離物質的吸附和洗脫都比較溫和，活性不易破壞。2020/11/2639二、緩沖液的選擇

離子交換劑不僅要與被分離的物質交換,還要求與緩沖液進行交換。選用的起始緩沖液，其pH值和離子強度等要么能使樣品中有效成分與離子交換劑結合，而不能使樣品中雜質與離子交換劑結合，pH值一般比有效成分的pI值高一個單位或低一個單位，就能把有效成分和雜質分開。或者選擇緩沖液的離子強度和pH值，使雜質和離子交換劑結合牢固，有效成分和離子交換劑結合不牢。洗脫液的選擇主要是使和離子交換結合的成分解離下來。離子強度比起始緩沖液高。緩沖液的選擇關鍵在于有效成分的等電點。對于一種提取分離的未知有效成分而言，其等電點須通過試驗才能確定。選擇緩沖液的方法(見P89)MoNoQ:陰離子交換層析,顆粒直徑10um,載量65mgBSA/mlMoNoS:陽離子交換層析2020/11/26402020/11/26412020/11/2642三、加樣量的確定層析時加樣量的多少除與離子交換劑的總交換容量大小關系密切外，還與樣品中有效成分的吸附性能以及有效成分與雜質之間的比例等因子有關。2020/11/2643第四節操作

一、交換劑的預處理、再生和轉型商品離子交換樹脂為干樹脂，因含有一些水不溶性雜質，所以要處理，一般程序如下：干樹脂加過量的水除去細顆粒，再用水浸泡2小時后減壓抽去氣泡，傾去水，再用大量去離子水洗至澄清，去水后加4倍量的2mol/LHCl溶液，攪拌4小時，除去酸液，用水洗至中性，再加4倍量的2mol/LNaOH溶液，攪拌4小時，除去堿液，用水洗至中性備用。處理時一般陽離子交換劑最后用堿處理，陰離子交換劑最后用酸處理。

如果是親水型離子交換劑，只能用0.5mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合溶液或0.5mol/LHCl溶液處理(室溫下處理30分鐘)。2020/11/2644離子交換劑的再生是指對使用過的離子交換劑進行處理，使其恢復原來性狀的過程。酸堿交替浸泡的處理方法就可以使離子交換劑再生。離子交換劑的轉型是指離子交換劑由一種平衡離子轉為另一種平衡離子的過程。如對陰離子交換劑用HCl處理可將其轉為Cl型，用NaOH處理可轉為OH型，用甲酸鈉處理可轉為甲酸型等等。對離子交換劑的處理、再生和轉型的目的是一致的，都是為了使離子交換劑帶上所需的平衡離子。

2020/11/2645長期使用后的樹脂含雜質很多，欲將其除掉，應先用沸水處理，然后用酸、堿處理之。長期使用的樹脂，需先用沸水處理，然后用酸處理，若含有脂溶性雜質，可用乙醇或丙酮處理。長期使用過的親水型離子交換劑的處理，一般只用酸、堿浸泡即可。對瓊脂糖離子交換劑的處理，在使用前用蒸餾水漂洗，緩沖溶液平衡后即可。離子交換劑去除雜質的原則：不破壞離子交換劑的結構和穩定性，不影響其原有的交換容量。2020/11/2646二、分離物質的交換有兩種方法：柱層析法（動態法）分批法（靜態法）離子交換劑的裝柱量，要依據其全部交換量和待吸附物質的總量來計算，當溶液中含有各種雜質時，必須考慮使其交換量留有余地。例子見書P932020/11/2647(1)離子交換層析柱選擇簡單的層析柱可用堿式滴定管代替，底部熔接有濾板。柱的高度依分離物質的不同而定，當所用的交換劑與待分離物質各組分之間的親和力相差不多而需要交換劑的體積較大時，可增加柱的長度，使待分離的組分被洗脫后再結合于交換劑上的概率增加，使性質相近的組分能較好地分離，因而增加了分辨率。柱的直徑與高度的比以1：20左右為宜。如采用離子強度較大的梯度洗脫時，以選用粗而短的柱子為宜柱高與直徑的比例要降低，甚至為2：1。因為當柱上洗脫液的離子強度高到足以完全取代被吸附的離子時，這些被置換的離子則以同洗脫液等速率從柱上向下移動，如果柱細長，即從脫附到流出之間的距離長，使脫附的離子擴散的機會增加，結果造成分離峰過寬，降低分辨率。用交聯葡聚糖離子交換劑和纖維素離子交換劑時，常用的柱高為15～20cm。三、樣品上柱、洗脫和收集2020/11/2648

(2)裝柱

轉型再生好的交換劑先放入燒杯，加少量水，邊攪拌邊倒人垂直固定的層析柱中，使交換劑緩慢沉降。交換劑在柱內必須分布均勻，不應有明顯的分界線，嚴防氣泡產生，否則將嚴重影響交換性能。為防止氣泡和分界線(即所謂“節”)的出現，在裝柱時，可在柱內先加入一定高度的水，一般為柱長的1／3，再加入交換劑就可借水的浮力而緩慢沉降。同時控制排液口放速率，以保持交換劑面上水的高度不變，交換劑就會連續地緩慢沉降，“節”和氣泡就不會產生。離子交換劑的裝柱量要依據其全部交換量和待吸附物質的總量來計算。當溶液含有各種雜質時，必須考慮使交換量留有充分余地，實際交換量只能按理論交換量的25％～50％計算。在樣品純度很低時，或有效成分與雜質的性質相近時，實際交換量應控制得更低些。2020/11/2649裝柱完畢，通過恒流泵加入起始緩沖溶液，流洗交換劑，直至流出液的pH與起始緩沖溶液相同。關閉層析柱出液口，準備加樣。打開柱出液口，待緩沖溶液下移至柱床表面時，關閉出液口。用滴管加入已用起始緩沖溶液平衡后的樣品。沿柱內壁滴加樣品，待樣品液加到一定高度后，再移向中央滴加，務必使樣品液均勻分布于柱床全表面。然后打開出液口，待樣品液全部流人柱床時，先用少量起始緩沖溶液沖洗柱內壁，再接上洗脫裝置，按一定速率加入洗脫液，開始層析分離。2020/11/2650經過離子交換被吸附在離子交換劑上的待分離物質，有二種洗脫辦法：一是增加離子強度，使洗脫液中的離子能爭奪交換劑的吸附部位，從而將分離的物質置換下來；二是改變pH，使樣品離子的解離度降低，電荷減少，因而對交換劑的親和力減弱而被洗脫下來。從洗脫液的成份而言，洗脫方式有三種：一是選用單一洗脫液。此為恒液洗脫法，適用于組分不大復雜的樣品；二是選用幾種洗脫能力逐步增強的洗脫液相繼洗脫，此為階段洗脫法，適用于各組分對交換劑親和力比較懸殊的樣品；三是用離子強度和pH呈連續梯度變動的洗脫液進行洗脫，使洗脫能力持續增強，此為梯度洗脫法，適用于各組分與交換劑親和力相近的樣品。

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在離子交換層析過程中，常用梯度溶液進行洗脫，溶液的梯度是由鹽濃度或酸堿度的變化形成的。2020/11/26522020/11/2653由于被吸附的物質不一定是所要求的單一物質，因此除了正確選擇洗脫液外，還采用控制流速和分部收集的方法來獲得所需的單一物質。因不同物質的極性不同，容易交換的先流出來，根據先后順序就能得到較純的物質。2020/11/2654

洗脫液的流速不僅與所用交換劑的結構、顆粒大小及數量有關，而且與層析柱的粗細及洗脫液的粘度有關，很難定出一定的標準，必須根據具體條件，反復實驗，才能得出適合于特定層析條件的洗脫液流速，一般控制在5～8mL／(cm2?h)。經洗脫流出的溶液可用部分收集器分部收集，收集的體積一般以柱體積的1％～2％為宜。若降低分部收集體積，可提高分辨率。分部收集洗脫液經相關的檢測分析，便可得知所含物質的數量。也可以用監測儀顯示收集的洗脫液在特定波長的吸光度(A)代表被分離物質的濃度，以此為縱坐標，以相應的洗脫體積為橫坐標，繪制出洗脫曲線。2020/11/2655

在某些實驗條件下，離子交換層析的洗脫，也選用階梯式或復合式梯度洗脫液。實踐中采用何種形式的梯度洗脫，完全決定于分離要求，無規律可循。一般從線性梯度開始，然后逐步摸索試驗，以獲得適用于實驗的合適洗脫方式。2020/11/2656部分收集器梯度混合器層析柱柱層析設備可見光分光光度計蠕動泵2020/11/2657

企業利用的層析柱2020/11/2658第五節離子交換層析的應用離子交換層析的應用范圍很廣，主要有以下幾個方面。(1)水處理離子交換層析是一種簡單而有效的去除水中的雜質及各種離子的方法，聚苯乙烯樹脂廣泛的應用于高純水的制備、硬水軟化以及污水處理等方面。純水的制備可以用蒸餾