農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物抽制樣與檢測(cè)技術(shù)陳平華農(nóng)業(yè)部甘蔗及制品質(zhì)檢中心轉(zhuǎn)基因檢測(cè)室福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗所內(nèi)容提綱我省轉(zhuǎn)基因送檢樣品存在的問(wèn)題農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物抽制樣的特點(diǎn)抽樣和制樣的基本要求轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品抽樣和制樣轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)試紙條快速檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)示范一、我省轉(zhuǎn)基因送檢樣品存在的問(wèn)題

問(wèn)題：1、樣品量差異大：幾十克-幾百克2、包裝不規(guī)范：塑料包裝袋、紙質(zhì)袋，只有代號(hào)或名稱(chēng)3、不注意防止污染：密封性不夠4、二次送樣現(xiàn)象：對(duì)一次檢測(cè)結(jié)果存疑后果：檢測(cè)結(jié)果誤差大；追溯性差；假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)；成本增加……二、農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物抽制樣的特點(diǎn)1、農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物抽制樣是否遵循抽制樣的基本理論？

是，以數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)和概率論為理論基礎(chǔ)建立起來(lái)，基本的抽樣方法同樣適用：?jiǎn)渭冸S機(jī)抽樣、系統(tǒng)抽樣、分層抽樣等

2、農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物抽制樣與其他種類(lèi)的抽制樣相同嗎？

與其他單純以重量為基礎(chǔ)的抽樣有較大區(qū)別，特點(diǎn)：1、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)以遺傳物質(zhì)DNA為模板，抽制樣是以生物最小遺傳單位為基礎(chǔ)，與種子顆粒大小密切相關(guān)。2、樣本大小根據(jù)二項(xiàng)分布、轉(zhuǎn)基因限量水平和顆粒重計(jì)算獲得：P(0)=(1-P)n，P(0):假陰性結(jié)果的可能性；P：轉(zhuǎn)基因含量，n：檢測(cè)樣本中顆粒數(shù)量，假設(shè)：GMO0.1%樣本3000粒則P(0)=0.0497（0.05）置信度=1-P(0)=95%。3、防止污染是重中之重：轉(zhuǎn)基因檢測(cè)靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12g)量級(jí)的模板擴(kuò)增到微克(ug=10-6g)水平。能在一個(gè)試管內(nèi)將所要檢測(cè)的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍，能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。

抽取不同批次樣品要用不同抽樣器材，盛放樣品容器或包裝一次性使用（GB19495.7-2019）三、抽樣和制樣的基本要求抽樣的重要性：通過(guò)部分了解整體；減少資源浪費(fèi)；節(jié)省時(shí)間，提高效率；保存檢測(cè)對(duì)象的價(jià)值（毀滅性質(zhì)的抽樣，必須用抽樣檢查）。抽樣方法根據(jù)抽樣對(duì)象確定：抽樣方法依據(jù)數(shù)理統(tǒng)計(jì)和概率論建立，不同種類(lèi)物質(zhì)遵循統(tǒng)計(jì)學(xué)原理不同。抽樣對(duì)象種類(lèi)多樣：形態(tài)上有固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)，組分上有均勻和不均勻批，還有原始材料和加工產(chǎn)品等。顯然對(duì)于不同的分析對(duì)象和分析要求，分析前試樣的采集及制備也是不同的。因此采樣及制備樣品的具體步驟應(yīng)根據(jù)分析的要求、試樣的性質(zhì)、均勻程度、數(shù)量多少等等來(lái)決定。一般情況下，經(jīng)常使用隨機(jī)采樣和計(jì)數(shù)采樣的方法。

抽樣方法十分重要：采樣誤差常大于分析誤差，因此，掌握采樣和制樣的一些基本知識(shí)是很重要的，如果采樣和制樣方法不正確，即使分析工作做得非常仔細(xì)和正確也是毫無(wú)意義的,，有時(shí)甚至給生產(chǎn)科研帶來(lái)嚴(yán)重的后果。抽樣的基本目的和注意事項(xiàng)

基本目的:從被檢的總體抽樣對(duì)象中取得有代表性的樣品，通過(guò)對(duì)樣品的檢測(cè)，得到在容許誤差內(nèi)的數(shù)據(jù)，從而求得被檢抽樣對(duì)象總體的某一或某些特性的平均值及其變異性。

注意事項(xiàng)：采樣前，應(yīng)調(diào)查抽樣對(duì)象的貨主、來(lái)源、種類(lèi)、批次、生產(chǎn)日期、總量、包裝堆積形式、運(yùn)輸情況、貯存條件、貯存時(shí)間、可能存在的成分逸散和污染情況，以及其他一切能揭示抽樣對(duì)象發(fā)生變化的材料。采樣時(shí)，選擇不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的材料制成的采樣器。如果采樣時(shí)間較長(zhǎng)，中間樣品用氣密容器保存。盛樣容器要依分析項(xiàng)目和被檢抽樣對(duì)象的性質(zhì)而定。

采樣后，要及時(shí)記錄樣品名稱(chēng)、規(guī)格型號(hào)、批號(hào)、等級(jí)、產(chǎn)地、采樣基數(shù)、采樣部位、采樣人、采樣地點(diǎn)、日期、天氣、生產(chǎn)廠家名稱(chēng)及詳細(xì)通訊地址等內(nèi)容。樣品制備的目的和原則制備的目的：從較大量的原始樣品中獲取最佳量的、能滿(mǎn)足檢驗(yàn)要求的、待測(cè)性質(zhì)能代表總體抽樣對(duì)象特性的樣品。制備的原則：

1、同概率：原始樣品的各部分應(yīng)有相同的概率進(jìn)人最終樣品。2、高保真：制備技術(shù)和裝置在樣品制備過(guò)程中不破壞樣品代表性，不改變樣品組成，不使樣品受到污染和損失。3、縮粒度：在檢驗(yàn)允許的前提下，為了不加大采樣誤差，應(yīng)在縮減樣品的同時(shí)縮減粒度。

4、合理性：應(yīng)根據(jù)待測(cè)特性、原始樣品的量及粒度以及待采樣抽樣對(duì)象的性質(zhì)確定樣品制備的步驟及應(yīng)采用的技術(shù)。最終樣品的量及保存樣品的量：應(yīng)滿(mǎn)足檢測(cè)及備查的需要。把樣品一般等量分成兩份。一份供檢測(cè)用，一份留作備查。每份樣品量至少應(yīng)為檢驗(yàn)需要量的三倍。保存：1、惰性的包裝材質(zhì)，合適的包裝形式，貼上有規(guī)定內(nèi)容的標(biāo)簽，樣品制成后應(yīng)盡快檢驗(yàn)。2、備檢樣品貯存時(shí)間一般為六個(gè)月。根據(jù)需要和樣品特性，可以適當(dāng)延長(zhǎng)和縮短。四、轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品抽樣和制樣抽制樣的基本原則1、影響檢測(cè)準(zhǔn)確性的因素（誤差）抽樣方法（sampling）隨機(jī)抽樣、系統(tǒng)抽樣、分層抽樣樣品制備（samplereparation）:保真性檢測(cè)方法（analyticalmethod）：PCR試紙條2、抽樣原則樣品應(yīng)具備良好的代表性

樣品應(yīng)能代表某批貨物（宏觀代表性）以及該批貨物的內(nèi)部的特性（微觀代表性）選擇合理的抽樣方法:應(yīng)根據(jù)抽樣對(duì)象的特性采用相應(yīng)的抽樣方法。中粒和大粒固體、小粒固體、植株、單位產(chǎn)品較大樣品、加工品、液體等。嚴(yán)防污染:外部污染、包裝、交叉污染等制定轉(zhuǎn)基因抽樣方案需考慮的因素根據(jù)抽樣對(duì)象均一性確定抽樣單位：生產(chǎn)日期、包裝等分批根據(jù)檢測(cè)方法確定抽樣目標(biāo)：DNA-生物體，蛋白分離物根據(jù)抽樣對(duì)象形態(tài)種類(lèi)確定抽樣方法：樣品代表整體，隨機(jī)抽樣？系統(tǒng)抽樣？分層抽樣？初次樣品量（份樣量）0.5kg,1000mL?根據(jù)抽樣對(duì)象量確定抽樣點(diǎn)和位置：5點(diǎn)？50點(diǎn)？分區(qū)設(shè)點(diǎn)（5、8、11‥‥）、分層（2、3、4‥‥）等統(tǒng)計(jì)學(xué)因素、可操作性和經(jīng)濟(jì)因素：可行性與成本轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品抽樣指南原始材料（rawmaterials）：植物組織、種子、水果等加工產(chǎn)品（processedproducts）：面粉、米粉、淀粉、大豆蛋白、動(dòng)物飼料等深加工產(chǎn)品（highlyprocessedproducts）：醬汁、罐裝食品、植物油等如DNA降解或分離，檢測(cè)靈敏度降低，或不能作為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)樣品取樣類(lèi)型取樣時(shí)間、地點(diǎn)倉(cāng)庫(kù)或儲(chǔ)存罐抽樣裝卸時(shí)抽樣田間抽樣加工時(shí)抽樣抽樣工具及設(shè)備交付批（consignment）：一次提交、發(fā)送或接受的植物或植物產(chǎn)品，它可由一批或多批組成。批、檢驗(yàn)批（lot）:成分和產(chǎn)地等均相同的一系列單位產(chǎn)品，構(gòu)成交付批的一部分。在抽樣中，指轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)的取樣單位。批量（lotsize）:一批植物或植物產(chǎn)品的量，它等于交付批的質(zhì)量除以交付批含有的批數(shù)。大豆、玉米、棉花種子25t,油菜、番茄等種子、加工品10t。均勻批（homogenouslot）:待檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因成分遵循一定的概率規(guī)律在該批植物或植物產(chǎn)品中呈均勻分布的批。不均勻批（heterogenouslot）:待檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因成分在該植物或植物產(chǎn)品中分布不均勻。轉(zhuǎn)基因限量水平（acceptableGMOqualitylevel）:抽樣驗(yàn)收時(shí)，規(guī)定的交付批中含有的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的可接受量，一般使用質(zhì)量百分含量表示(質(zhì)量/拷貝數(shù))。0.1%,0.5%。術(shù)語(yǔ)和定義實(shí)驗(yàn)室樣品（laboratorysample）：由混合樣品經(jīng)過(guò)混勻、縮分得到的一定數(shù)量樣品。用于制備送驗(yàn)樣品和存查樣品。送驗(yàn)樣品（submittedsample）：送到檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)、規(guī)定數(shù)量的樣品，由全部或部分實(shí)驗(yàn)室樣品進(jìn)一步均勻化得到的用于分析或測(cè)試的樣品。存查樣品（restoresample）：從實(shí)驗(yàn)室樣品中分取的用于備查的一定數(shù)量樣品。混合樣品或原始樣品（compositesample）從一批內(nèi)抽取的全部初次樣品經(jīng)過(guò)混合而成初次樣品（primarysample）:從一批的一個(gè)抽樣點(diǎn)上所抽取的以小部分樣品。對(duì)同批植物或植物樣品而言，從不同點(diǎn)抽取的初次樣品一般應(yīng)具有接近的量術(shù)語(yǔ)和定義取樣流程初次樣品(份樣)混合混合樣品(原始樣品)實(shí)驗(yàn)室樣品存查樣品縮分批送驗(yàn)樣品縮分抽樣點(diǎn)和位置世界各國(guó)轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)閾值抽樣方法GBT19495.7-2019轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)抽樣和制樣方法原始樣品最少顆粒數(shù)可根據(jù)不同品種植物或植物產(chǎn)品的籽粒平均質(zhì)量計(jì)算原始樣品的最小質(zhì)量。原始樣品最小質(zhì)量轉(zhuǎn)基因限量水平為1%時(shí)幾種谷物的原始樣品最小質(zhì)量抽樣點(diǎn)數(shù)單位產(chǎn)品較大的貨物及小批量貨物的原始樣品最小數(shù)量“n”表示當(dāng)批中包含的單位產(chǎn)品數(shù)小于10時(shí)，應(yīng)從全部單位產(chǎn)品中抽取樣品。該表是以轉(zhuǎn)基因限量水平為0.5%為依據(jù)的，當(dāng)?shù)陀谶@值時(shí)，可適當(dāng)提高原始樣品中包含的最小單位產(chǎn)品數(shù)。最小份樣量及包裝貨物取樣最小份樣量包裝貨物取樣上表中的包裝件數(shù)僅指外包裝，當(dāng)含有小包裝時(shí)，應(yīng)交替從每個(gè)選取的外包裝的不同位置（如頂部、中部、和下部或左、中、右）抽取數(shù)量一致的小包裝。抽取包裝液體貨物的樣品時(shí)，需事先將其混勻，再將所需量的倒入樣品容器進(jìn)行抽樣。散裝貨物及液體抽樣方法散裝貨物的抽樣確定抽樣點(diǎn)數(shù)和位置貨物流動(dòng)過(guò)程中取樣：按批量和貨物流動(dòng)速度確定抽樣間隔，每一個(gè)間隔內(nèi)選取一個(gè)點(diǎn)抽取一個(gè)樣，以此類(lèi)推貨車(chē)、船艙等載貨容器中抽樣：抽取固體樣品時(shí)，應(yīng)在載貨容器內(nèi)均勻布點(diǎn)抽樣；當(dāng)貨物量大于三倍批量時(shí)，按分層抽樣法，即先在貨物的初始表面均勻布點(diǎn)取樣，當(dāng)裝卸到中、下層，再分別在露出的表面均勻取樣。抽取液體樣品時(shí)，按表格所示的比例取樣。抽樣方法

(NY-T673-2019轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測(cè)抽樣)散裝貨物的抽樣散裝大豆、玉米、棉花、油菜和番茄種子、大豆粉、玉米粉的抽樣點(diǎn)數(shù)規(guī)定散裝油脂抽樣部位和抽樣點(diǎn)規(guī)定抽樣操作：用雙套管抽樣器、抽樣鏟抽樣操作：按一個(gè)容器為單位，1500mL，用底部抽樣器抽樣方法件裝貨物（含油脂）的抽樣抽樣操作：用單管抽樣器、抽樣鏟（油脂用抽樣管、套管抽樣器）送檢樣品最小量混合樣品量：送檢樣品2-3倍縮分縮分四分法用二塊分樣板將樣品攤成正方形，然后從樣品左右兩邊鏟起樣品約10cm高，對(duì)準(zhǔn)中心同時(shí)倒落，再換一個(gè)方向同樣操作。將樣品按照測(cè)定要求平鋪分成四等分，取相對(duì)的兩份混合，然后再平分，直到達(dá)到自己的要求。點(diǎn)取法將樣品傾與清潔的方盤(pán)內(nèi)，用分樣板仔細(xì)混勻，平鋪成均勻厚度的方形，劃分棋盤(pán)格，用小鏟從每個(gè)小格鏟取樣品，不少于16份。分樣器縮分法分樣器由漏斗、分樣格和接樣斗等組成，樣品通過(guò)分樣格被分成二部分。漏斗份樣格接樣斗制樣方法破碎和研磨采用對(duì)樣品不產(chǎn)生污染的設(shè)備預(yù)先使用小量樣品清洗設(shè)備調(diào)整設(shè)備的操作參數(shù)，避免過(guò)熱并防止樣品粘連

高壓均質(zhì)機(jī)（細(xì)胞破碎機(jī)）冰凍研磨機(jī)實(shí)驗(yàn)室建立物理分隔區(qū)，各區(qū)間設(shè)置緩沖帶，安裝紫外燈和抽風(fēng)設(shè)置，專(zhuān)用的試驗(yàn)設(shè)備安放在制定的試驗(yàn)區(qū)域內(nèi)，應(yīng)有明確的標(biāo)識(shí)，試驗(yàn)結(jié)束后，要立即清潔試驗(yàn)器具，紫外殺菌處理。制樣方法樣品的盛裝、標(biāo)識(shí)和運(yùn)送盛裝標(biāo)識(shí)運(yùn)送用容量、規(guī)格適當(dāng)?shù)娜萜骰虬b袋盛裝抽取的樣品并密封。抽取的樣品應(yīng)加貼唯一的標(biāo)簽，包括樣品編號(hào)、貨物名稱(chēng)、品種或批號(hào)、抽樣時(shí)間、抽樣人、及任何必要信息。應(yīng)在盡可能短的時(shí)間內(nèi)傳遞和運(yùn)送，運(yùn)送的環(huán)境條件應(yīng)根據(jù)樣品的性質(zhì)確定，大多應(yīng)在避光、干燥條件下運(yùn)送和保存。

送驗(yàn)樣品驗(yàn)收合格并按規(guī)定要求登記后，應(yīng)將樣品分為三份，一份作檢測(cè)，一份作復(fù)檢，一份作備查。送檢樣品保留6個(gè)月。番茄醬等含水量大的樣品短期內(nèi)(90天)可保存在-20

℃;對(duì)于有些因特殊需要需長(zhǎng)期保存的樣品，建議保存在-80℃，以保證DNA和蛋白質(zhì)分子的完整性，不影響其中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)。液體樣品解凍后，建議用適當(dāng)?shù)奶幚恚员ＷC檢測(cè)樣品的均勻度，并立即進(jìn)行樣本檢測(cè)。大豆、玉米種子、玉米、油菜種子、油菜籽、棉花種子、番茄種子、大豆粉、玉米粉等干燥樣品和大豆油、玉米油、油菜籽油樣品可以在4℃環(huán)境中干燥密封保存。樣品保存轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品抽制樣注意事項(xiàng)嚴(yán)格防止交叉污染：一次性手套、一次性取樣用品、一次性分樣用品、一次性盛裝用品抽樣量：必須達(dá)到規(guī)定的最低質(zhì)量均一性：抽制樣方法留備樣：與送檢樣性質(zhì)相同抽樣報(bào)告抽樣報(bào)告應(yīng)真實(shí)反映現(xiàn)場(chǎng)抽樣工作過(guò)程和貨物狀況，包括以下內(nèi)容貨物名稱(chēng)貨物包裝形式和包裝狀況，標(biāo)記情況交付批數(shù)量或質(zhì)量分批方法及質(zhì)量抽樣方法，包括抽樣件數(shù)等樣品編號(hào)抽樣時(shí)間抽樣現(xiàn)場(chǎng)的環(huán)境狀態(tài)及現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)情況抽樣人的標(biāo)識(shí)任何發(fā)現(xiàn)的異常情況抽樣單示例五、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù):

試紙條快速檢測(cè)與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法（一）、試紙條檢測(cè)技術(shù)原理試紙：襯板、樣品墊、吸收墊、結(jié)合墊、硝化纖維膜(NC膜)、檢測(cè)帶和控制帶等組成。樣品墊是試紙條檢測(cè)時(shí)直接與樣品溶液互相接觸部分，過(guò)濾非可溶性雜質(zhì)；結(jié)合墊含標(biāo)記有免疫膠體金顆粒的金標(biāo)抗體，可與目標(biāo)蛋白發(fā)生抗原-抗體特異性結(jié)合；檢測(cè)帶含有與目標(biāo)蛋白發(fā)生抗原‐抗體特異性反應(yīng)的捕獲抗體；控制帶含有與過(guò)量的金標(biāo)抗體發(fā)生抗原‐抗體特異性反應(yīng)的捕獲抗體。試紙條檢測(cè)流程批樣(10噸)

檢測(cè)樣品(0.2g)試紙條檢測(cè)檢測(cè)樣品

抽樣試紙條檢測(cè)方法優(yōu)點(diǎn)：快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確。缺點(diǎn)：僅適用外源蛋白質(zhì)；檢測(cè)靶標(biāo)種類(lèi)少；靈敏度有限；無(wú)相應(yīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用：快速篩查、現(xiàn)場(chǎng)復(fù)核。商品化試紙條抗蟲(chóng)類(lèi)：Cry1Ab/Ac、Cry2Ab、Cry1F、Cry3A、Cry3Bb、Cry34Ab1、Vip3A、Cry9C、Cry1C抗除草劑類(lèi)：CP4EPSPS、PAT/BAR抗生素抗性：NPTII多重試紙條：同時(shí)檢測(cè)多種外源蛋白質(zhì)CP4EPSPSBt-Cry2A試紙條檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)基因元件CaMV35S、FMV/TSF1、BAR、PAT、BLA、CP4、EPSPS、Cry1Ab、Cry1AC、Cry1F、GUS、Hpt、NPTII、T-35S、T-NOS、T-pinII（二）、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法大豆轉(zhuǎn)化事件：A2704-12、A2704-21、A5547-35、A5547-127、BPS-CV127-9、DP305423、DP356043、G94-1、G94-19、G168、GTS40-3-2、GU262、MON87701、MON87705、MON87769、MON89788、W62、W98玉米轉(zhuǎn)化事件：676678680、59122、98140、3272、(SYN-E3272-5)、B16(DLL