基因組測序與序列組裝基因組測序與序列組裝基因組計劃的最終目標是獲得所研究的生物的完整的DNA順序。最佳狀況是將物理圖譜和遺傳圖譜進行有機整合,以確定基因以及其他重要的序列在DNA順序中的位置主要內(nèi)容1.DNA測序的方法2DNA序列的組裝3.基因組測序的其他路線4.人類基因組的測序和組裝4.1DNA測序的方法DNA測序技術(shù)主要有兩種方法,都是在20世紀70年代中期發(fā)明的。A.雙脫氧鏈終止法(thechainterminationmethod),是通過合成與單鏈DNA互補的多核苷酸鏈來讀取待測DNA分子的順序。B.化學降解法(chemicaldegradationmethod),是將雙鏈DNA分子用化學試劑處理,產(chǎn)生切口,用同位素標記進行測序A.雙脫氧鏈終止法原理DNA復(fù)制模板DNA、DNA聚合酶、引物、4種dNTP政(的加在反廢愛統(tǒng)雙知3(基)核就三止延伸,鏈端摻入單脫氧核苷酸的片段可繼續(xù)延如此得到3端終止于ddNTP的一系列長度不等的核酸片段4個反應(yīng)體系中分別加入4種不同的ddNTP,濃度低于dNTP。反應(yīng)終止后,分四個泳道進行聚丙烯酰胺凝膠),分離長短不一的核酸片段(長度相鄰者僅差一個堿基),根據(jù)片段3'端的雙脫氧堿基,可依次閱讀合成片段的堿基排列順序A.雙脫氧鏈終止法TAAGCTCGACTdotp,dGTP.dATP.dTTHdETPGATESGAGITddtCUdaGAddA.雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法對DNA多聚酶的要求高酶活性無5’一3·外切核酸酶活性,5’一3’外切核酸酶使DNA聚合酶去除已存在的鏈無3’-5’外切核酸酶活性,3-5外切核酸酶使DNA聚合酶校正自身錯誤天然的DNA聚合酶不能滿足,需要進行改造Klenow聚合酶:來自大腸桿菌DNA聚合酶I,外切酶活性去除,酶活性不夠,250bp測序酶Sequenase:噬菌體T7編碼A.雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法要求單鏈作為模板:將DNA克隆到質(zhì)粒載體中:堿變性或熱變性變?yōu)閱捂滊p向測序;污染,干擾以M13載體克隆單鏈DNA:無需變性,直接測序3kb,擴增時容易發(fā)生丟失與重排,小片段DNA測序以噬菌粒(phagemid)克隆DNA:改造的質(zhì)粒載體2個復(fù)制起始點(質(zhì)粒自身和M13單鏈噬菌體在大腸桿菌細胞中產(chǎn)生單鏈噬菌粒,>10kbdnA測序PcR產(chǎn)生單鏈DNA中英聯(lián)合實驗室模板DNA工基正常引物攜帶金屬粒引物PCR自血郵□_■可r-hn吸磁法收集擴增引物A.雙脫氧鏈終止法通過M13載體獲得單鏈DNA以測序DM距入H段是利用M13噬菌體在式齡菌體外能以單鏈形式存在。將待測序DNA片段連接到M13載體中去再利用引物,進行DNA合成,并在合成系統(tǒng)中加入dNTPA.雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法中引物的影響:引物決定了模板鏈的測序起點,一般來說,是采用克隆位點附近載體上的一段順序載體DNAA通用引物:與載體DNA中附近插