生物化學(xué)與分子生物學(xué)

DNA重組和重組DNA技術(shù)DNARecombinationandRecombinantDNAtechnology第二十一章DNA重組（DNArecombination）是指不同DNA分子斷裂和連接而產(chǎn)生DNA片段的交換并重新組合形成新DNA分子的過程。重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnology）是指在體外將兩個或兩個以上DNA分子重新組合并在適當(dāng)細(xì)胞中增殖形成新DNA分子的過程。第榜一嘩節(jié)自暈然配界D昌N年A重磁組叛和帆基水因霸轉(zhuǎn)創(chuàng)移D雀N適A脈R肢e亞c砍o敢m賺b久i軌n鵲a強(qiáng)t侵i金o學(xué)na岡n效d遞G愚e啦n靠e蜓T觸r花a負(fù)n拔s寸f桃e秀r響i然n溪N驚a露t緊u晌r香eD資N傾A重調(diào)組同剖源碧重忙組(陪h假o乖m妥o(hù)隆l綿o石g射o語u慌s舅r閑e糾c全o袖m巖b覺i兇n嘉a陣t民i決o已n意)位塔點(diǎn)規(guī)特竿異啄的眨重坊組(焰s邁i占t熔e沸-鐮s張p雕e劣c詢i響f前i央c拐r侄e肉c逼o謹(jǐn)m墓b住i遭n引a闖t維i脖o母n賞)轉(zhuǎn)補(bǔ)座好重粒組(娃t曉r退a恒n世s軍p腳o金s升i千t爛i殖o秧n伏r轎e表c勿o駐m件b版i彈n沙a籃t未i地o榮n煮)接筆合話作蛋用(任c很o虎n嚴(yán)j垃u妄g夕a援t層i甜o攔n顛)轉(zhuǎn)王化故作帽用(體t登r興a盛n牢s擠f怠o宴r斃m(xù)薪a賄t弊i精o喘n介)轉(zhuǎn)對導(dǎo)峽作練用(礙t年r籠a封n姑s冷d匙u(yù)括c畢t搞i風(fēng)o障n城)發(fā)遺生酬在豬同浴源碑序彩列震間遍的集重馬組絲式稱爛為同趕源辦重早組(抹h哪o尺m賴o郵l蓋o禾g楚o參u醉s附r下e描c贊o副m陷b槍i駱n尺a館t漂i聞o巖n吩)，又謹(jǐn)稱基尸本酷重草組艦（g懶e灘n急e跡r接a助l闊r頁e杜c每o辜m綁b央i皂n隆a澇t丟i隸o蛾n）。截是螺最乏基伴本列的D委N加A重咽組北方公式抹，覽通映過奔鏈然的零斷貍裂執(zhí)和聞再篩連鑼接局，零在玩兩甩個D喇N恒A分咱子歐同聞源餓序卷列縮慧間宮進(jìn)惹行閘單計鏈裳或開雙僅鏈釘片猜段膝的姑交麻換市。以E纏.累c通o循l西i的格同陣源晃重淋組諒為母例旨，茄了僻解火同皂源偷重賺組昏機(jī)艙制埋的H店o生l爺l族i往d嶄a提y模伐型一內(nèi)、巾同貨源粥重送組嶄是秧最蜓基趕本鍬的D半N杏A重預(yù)組綿方香式H憐o雅l習(xí)l像i央d微a患y模化型污的4個囑關(guān)跌鍵紛步抄驟德：兩牙個嗚同哀源趁染陡色漲體D環(huán)N塌A排樓列插整壤齊惱；片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)一左個D罰N盾A的慕一壁條停鏈鈴斷直裂悲、商并落與謙另瘋一允個D殺N拾A對拳應(yīng)面的雖鏈應(yīng)連鏟接里，電形參成H胞o雖l監(jiān)l細(xì)i捎d枕a森y中訊間腥體萄；通稈過智分圖支旱移劃動擦產(chǎn)錫生隙異當(dāng)源塞雙君鏈D師N謹(jǐn)A；H燙o欄l諸l鵝i蜻d更a蠶y中雄間粒體蜜切丑開次并詢修彼復(fù)緞，稿形壇成認(rèn)兩蛾個焦雙線鏈藝重斧組狼體D飽N襖A，排分內(nèi)別粉為梳：片段段漲重哈組工體（阻見婦模木型召圖城左環(huán)邊游產(chǎn)包物觀）任：切以開刮的宜鏈?zhǔn)僚c庭原攏來穿斷至裂訊的蒜是貼同省一公條補(bǔ)鏈促，燒重矩組示體齡含英有駛一拾段吧異愛源隊雙雜鏈我區(qū)哄，滔其晨兩腔側(cè)鮮來口自刪同光一暫親話本D到N懂A。拼案接規(guī)重位組憲體（泉見衛(wèi)模追型渠圖郵右始邊序產(chǎn)六物爬）班：切冠開腿的售鏈江并陸非援原河來下斷有裂棄的郵鏈?zhǔn)澹拗仄M悼體春異館源勾雙款鏈終區(qū)溝的逆兩磨側(cè)拜來唐自輔不皮同滋親琴本D修N鹿A。參及與泳細(xì)厘菌D甲N移A同首源酒重些組嘴的猶酶蔽有倍數(shù)銹十鈔種兵，序其澆中伐最申關(guān)遞鍵傷的聯(lián)是R凝e里c尸A蛋賽白、R身e盟c越B禿C衰D復(fù)厲合寒物和R尤u糊v獸C蛋眉白。R達(dá)e獄c底B籠C弄D復(fù)鑄合姓物具烘有飛三探種尚酶淚活求性編，狗即憤依給賴鐵于A什T屑P的俯核羞酸飛外娛切困酶絕活麗性績、群可弄被A稍T袋P增礙強(qiáng)框的鄰核苦酸戒內(nèi)督切夏酶起活尚性弊以鑒及烏需獅要A樹T孤P的李解糾螺舊旋附酶活活斷性陸。R揪e尤c俯A蛋巨白可糾結(jié)旦合劣單匠鏈D粉N收A（s益s僅D胃N煙A）寒，蛛形濱成R墻e炒c病A偉-降s踏s不D農(nóng)N夸A復(fù)辟合價物廈。R望u雞v填C有炮內(nèi)調(diào)切舍酶鼻活純性廳，過能赤專輪一蝴性睬識差別H游o攏l先l垃i撕d貍a扣y連擦接扯點(diǎn)拼，遼并截有咐選韻擇滑地宅切舞開助同金源粒重則組墳體獄的部中停間媽體棍。

內(nèi)切酶

(recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移

(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′H兆o(hù)廟l堂l命i售d丟a蟲y中喪間枕體5′3′5′3′5′3′5′3′Holliday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5麗′5′3′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片挺段站重失組粗體拼向接蔬重倦組刷體二容、非位恩點(diǎn)螞特錯異鏡重苗組戚是戀發(fā)偵生廁在皺特懂異解位刃點(diǎn)永間長的D渴N汗A整課合位歐點(diǎn)打特拜異林重盒組(圍s掘i瞧t廚e錄-物s廚p啦e滑c昂i救f叮i迅c誤r弦e問c傅o當(dāng)m流b掛i嫌n依a飛t釀i蕉o笨n跡)是婚由幻玉整狐合妄酶捏催驅(qū)化倦，亂在間兩蠶個D貼N供A序解列聚的座特艦異晨位筒點(diǎn)難間竄發(fā)漢生棉的脊整晴合索。λ噬兵菌帝體庸的獲整灣合販酶逗識延別色噬練菌慈體報和俘宿接主巾染賄色秒體召的驚特脾異晶靶隊位誰點(diǎn)傾發(fā)蛾生池選薦擇疫性仔整船合秋；穗反抽轉(zhuǎn)逃錄榜病危毒剃整愚合臟酶渡可咱特鎮(zhèn)異法地首識宅別銅、臂整啦合恥反仙轉(zhuǎn)屆錄軍病疏毒c嶄D據(jù)N洋A的長追末警端饅重縮慧復(fù)聾序眉列(沖l鉆o盒n脊g叛t梁e弟r魯m鏈i踢n脈a孝l充r催e芳p到e咐a形t漆,脫L誤T謠R份)。（所一昆）λ噬電菌姐體D封N獅A的軟整唱合（慰二溜）海細(xì)極菌唇的傷特壺異強(qiáng)位圈點(diǎn)彼重罪組沙猴門惑氏訂菌H片全段框倒枯位弊決捷定漏鞭塑毛示相仔轉(zhuǎn)油變仇。h他i討x為紅反辛向溉重籌復(fù)躲序覆列耳，罰它傳們速之旺間扛的H片侄段永可喉在H估i橋n控域制隙下犧進(jìn)聚行拆特央異內(nèi)位緒點(diǎn)搬重認(rèn)組(倒掃位)。H片甲段尋上棗有顧兩城個峰啟育動門子P，標(biāo)其拐一仍驅(qū)健動h觸i拜n基糕因頭表厘達(dá)響，絮另假一擁正醫(yī)向碑時燙驅(qū)偉動H廳2和r外H蠟1基驕因贏表喇達(dá)罰，傳反龜向(倒葉位)時H究2和r簽H幅1不膽表音達(dá)央。r嚇H視1為H縫1的掠阻跪遏棵蛋底白勒基慢因稅。H2鞭毛素

阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA啟動序列H1啟動序列沙建門屠氏溪菌H片宣段沙倒泛位棄決熱定繡鞭端毛脫相慢轉(zhuǎn)事變（月三撕）察免答疫刊球溜蛋佛白邊基載因鼻的巷重亦排免陷疫斧球齡蛋猾白(叫I狠g俗)，損由煤兩鏈條疤輕花鏈(塞L鏈)和魔兩看條釘重罷鏈(僵H鏈)組磚成榆，宜分尊別晝由代三包個紗獨(dú)并立晶的以基厘因廚族叢編峰碼姿，潛其槽中詞兩從個極編簽碼暗輕拆鏈(和)，癥一饞個答編口碼模重員鏈京。輕尺鏈旁的廉基蜻因本片對段員：重吹鏈耗的蒼基逗因幸片珠段版：LVJCLV

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DNA序列分析；④填補(bǔ)3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶①合成cDNA；②替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基限胞制徐性納核犯酸湊內(nèi)幸切號酶(r廚e季s拌t等r緣瑞i笨c宗t坊i愁o奪n令e漁n約d煮o薪n洋u撒c持l晌e嗚a臭s臘e烘)限僵制售性懂核立酸灰內(nèi)果切核酶(哥r蠢e由s昌t窩r挪i潑c觀t綢i值o提n撞e濤n箭d鼻o妻n競u互c合l餐e榨a帥s鏟e侮,威R票E安)是嚇一但類泉核須酸雞內(nèi)欄切換酶蜘，虜能褲識風(fēng)別面雙畝鏈D轎N層A分源子靠內(nèi)稅部免的該特流異勒序晌列,并舟裂鋪解酸磷動酸犬二刑酯望鍵核。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+B得a聾mH鋸Ⅰ定項義晨：與梅甲護(hù)基鋸化彩酶始共浮同神構(gòu)謹(jǐn)成蒸細(xì)府菌什的賀限母制嘉修偵飾堤系允統(tǒng)奏，模限侄制喂外響源D缺N贈A，庫保權(quán)護(hù)遠(yuǎn)自辦身D循N版A。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（蔬基賺因械工娃程剛技險術(shù)失中屢常壺用Ⅱ型豆）分桶類沿：作昌用古：第辯一悄個爭字喝母砍取系自各產(chǎn)棍生肺該租酶換的栽細(xì)顧菌倍屬西名含，蜘用司大標(biāo)寫海；第牧二緒、某第精三獨(dú)個斜字制母滋是讓該費(fèi)細(xì)銳菌悲的雞種秩名索，打用位小最寫茄；第蜂四潛個昆字幟母間代忠表節(jié)株齒；用什羅園馬例數(shù)擱字暫表哄示張發(fā)沉現(xiàn)攏的大先柏后鐮次忘序汽。命區(qū)名割：Hi驢ndⅢ

屬

系

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以質(zhì)粒為載體的D浪N堅A克隆過程（醫(yī)一墳）民目握的乒基誼因金的投分服離交獲挪取—軌—分化滋學(xué)舌合征成俯法要仙求千：財已團(tuán)知時目陜的館基尖因加的園核改苷邪酸槐序彎列陷或很其傍產(chǎn)窩物送的睜氨伯基梁酸性序柏列是。從雨基較因暑組D饅N腦A文它庫專和c抄D棄N斗A文碰庫疫中仔獲標(biāo)取俘目陡的D定N培A愿(見眾第2核0章)P嗽C吩R法(見介第2竭0章)其方他紙方朽法(見嚷第2鍋0章)化央學(xué)殖合德成池法證獲員取茂目擇的逃基政因由裙已遣知彼氨而基類酸竹序爐列哪推扣測謎可之能初的D扶N裙A序辨列溝。組帽織準(zhǔn)或?qū)眉?xì)建胞鼻染這色灘體D黎N平A基祖因艱片嗚斷克團(tuán)隆練載線體重櫻組D福N撿A分喬子含掙重澆組畜分朵子派的喊轉(zhuǎn)祖化管菌限扇制榮性騰內(nèi)裁切避酶受步體匪菌基益因投組D繼N敬A文畝庫存雹在撕于跌轉(zhuǎn)賺化州細(xì)益胞景內(nèi)工由贈克朽隆斑載減體迅所事攜霸帶浴的烈所愿有鴿基垃因管組D搜N況A的斯集曾合從鐮基若因毒組D崖N漠A文飯庫文獲稈取怎目報的筍基兄因限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫用綿隨暮機(jī)潔切友割萍的視真劇核照生浙物簡染臣色際體D魚N蹦A片娘段龍構(gòu)險建蓋基駐因拋文介庫mRNAcDNA

雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫

反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制從c姥D嗚N愁A(yù)文乏庫糕獲記取基目元的運(yùn)基牽因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT（倡二雜）拉載趕體代的膠選捏擇勢與羊構(gòu)饅建—析—選目澤的井不辦同繭，籌操判作鉗基第因罪的益性突質(zhì)氣不惡同銀，換載臺體孝的優(yōu)選僻擇甚和尖改籮建窯方非法鉆也雜不驢同蛋。目情的進(jìn)：①茄獲難得舟某功一缺目描的曉基喬因華或D叢N油A片曬段②偽獲糾得傅目據(jù)的D權(quán)N柱A片鴿段桌所繁編謊碼模的做蛋風(fēng)白橡質(zhì)載體插入DNA片段宿主細(xì)胞質(zhì)粒<5~10kb細(xì)菌，酵母λ噬菌體載體~20kb細(xì)菌黏粒~50kb細(xì)菌BAC~400kb細(xì)菌YAC~3Mb酵母不響同哥載狼體稅的畜克尖隆籌容扶量醫(yī)及郵適室宜咳宿歡主狗細(xì)護(hù)胞（凡三易）察目島的D敗N罪A與斯載綱體邀連驕接—奔—接方曠式罷：羅（1）單先一恒相籍同何黏逆端舍連姑接（2）不斥同去黏販端流連科接（3）通凳過為其尤他敏措毯施萍產(chǎn)股生良黏貪端呀進(jìn)添行提連包接黏疏端覆連萌接B欺a創(chuàng)mH跨Ⅰ切組割延反塑應(yīng)

GGATCCCCTAGGT頭4D必N孩A連餃接嗽酶1備5o率CGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連單事一沫相六同轉(zhuǎn)黏償端坦連改接不擔(dān)同冤黏謠端曬連匙接妹（霧定撕向扯克耽隆叨）EcoRⅠ切割位點(diǎn)Bg

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T(T)nT3′5′5′

3′3′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′P鄉(xiāng)豐C否R法針絲式對偶目北的D自N引A的5-和3-端架，智設(shè)粥計欠一羞對澆特停異昨引航物椒，抓在昆每替條事引躬物排的5-端括分肆別憐加廁上派不侵同轟的R炕E位族點(diǎn)疑，隨然霜后灰以靠目屆的D步N折A為勁模浩板鵝，啦經(jīng)P超C配R擴(kuò)基增顧便哥可幕得慎到程帶仍有理引濃物封序亮列貸的感目城的D湊N僻A，險再負(fù)用節(jié)相踏應(yīng)R桑E切耀割P烈C舌R產(chǎn)鴉物蠻，襖產(chǎn)守生決黏繞端白，猴隨破后啊便島可沒與厘帶扔有納相為同蝦黏稿端虧的該線極性場化聰載超體陪進(jìn)塘行劈燕有艘效遞連幣接晚。平侄端咽連雙接限蜘制掉性蓮內(nèi)矩切卻酶亦切流割圍產(chǎn)委生成的裁平纏端粘莖端碗補(bǔ)尤齊柴或晨切戲平科形薯成泊的距平腿端適攜用純于寸：目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連3團(tuán).粘-平初末像端宴連脆接黏-平師末鍛端辟連浸接少是故指板目善的D謙N宰A和沾載點(diǎn)體昂之在間音通堂過疤一曉端圓為拒黏術(shù)端扶、北另決一便端撇為固平哥端循的緣瑞方療式賺進(jìn)糊行吳連換接識。屬詳于恥定害向寨克痰隆受得體丸菌秘條蚊件叛：安龜全萄宿或主竊菌限階制俱酶捐和信重堪組裁酶隨缺矩陷處兵于話感授受詞態(tài)(匯c緊o閃m松p佩e遣t怒e造n超t族)導(dǎo)伯入慶方謠式兆：轉(zhuǎn)悉化(寬t懼r伙a郊n批s存f咱o麗r贊m母a豈t勸i舞o嫁n傻)轉(zhuǎn)勉染(突t本r或a候n老s須f渡e評c脾t課i但o惹n敞)感鳴染(售i溝n直f蒼e娛c耽t舌i赴o蜂n仰)（叉四反）煤重滲組D喘N災(zāi)A轉(zhuǎn)仆入民受著體開細(xì)滿胞—萄—轉(zhuǎn)1已.借丈助確載以體籍上窮的散遺田傳登標(biāo)最志理進(jìn)訓(xùn)行蓋篩吃選(是1翁)利授用被抗磨生井素枝抗行性丟標(biāo)滿志盟篩脫選(皆2爭)利筒用田基受因盟的免插傾入悠失逢活/插翼入狂表竭達(dá)特碧性李篩刺選(更3但)利斗用準(zhǔn)標(biāo)炎志拿補(bǔ)革救梯篩對選(祖4該)利押用昆噬茫菌壩體揪的潔包蠢裝飲特童性銀進(jìn)訊行糧篩任選（澤五鄉(xiāng)豐）勁重漆組別體挺的棗篩胞選包與浮鑒祝定—典—篩2錄.序榜列孝特隸異正性撈篩愁選(總1夢)R與E酶軌切買法(喬2感)P化C論R法(疏3行)核寧酸平雜斜交緩法(矩4格)報D母N哪A測怒序警法3促.親淋和野篩害選有法插犧入刃失抓活致篩樹選靠帶謎有睡重得組駁載柔體叉的香克此隆α互汪補(bǔ)漁篩粱選伸（皮藍(lán)-白洞篩熟選牛）菌燃落勢或艙噬睛斑拼原加位為雜區(qū)交兄篩碎選伸重數(shù)組便體重役組D醉N停A技淋術(shù)準(zhǔn)操江作送過劣程糧可薯形械象貓歸懸納燭為姻：小雞結(jié)分分離獲取目的基因選載體的選擇與構(gòu)建接目的DNA與載體連接

轉(zhuǎn)重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩重組體的篩選與鑒定重謠組D逐N臨A技辛術(shù)塞操證作悉的朽主沾要撇步索驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表