歡迎各位同學批評指正！7/3/2023.馬放哈爾濱工業大學環境科學與工程系城市水資源與水環境國家重點實驗室StateKeyLaboratoryofUrbanWaterResourceandEnvironmentDept.ofEnvironmentalScienceandEngineering,HIT微生物非培養技術的未知種群檢測與功能解析7/3/2023.主要內容傳統環境微生物分析方法面臨的挑戰現代環境微生物分析方法發展概述rDNA序列同源性微生物鑒定及其種群組成分析中的應用PCR擴增技術的應用核酸探針雜交技術的應用DNA指紋圖譜技術7/3/2023.傳統環境微生物分析方法面臨的挑戰

利用傳統的微生物純培養技術獲得單一的微生物包括純種分離和培養兩個過程。純種分離的方法很多，可歸納為兩大類：一類是單細胞或單孢子分離；一類是單菌落分離。7/3/2023.微生物與農業微生物與工業微生物與醫學微生物與環境保護微生物與能源開發傳統環境微生物分析方法面臨的挑戰傳統微生物培養技術的現狀——微生物與人類社會7/3/2023.

在分子生物學誕生的20多年時間里，人們運用基因工程的幾大基本技術：凝膠電泳技術、核酸分子雜交技術、細菌轉化技術、DNA序列分析技術及基因定點突變技術，對食品、醫學、農業及環境保護等各個領域的應用微生物進行基因改造，實現了人為改造或修飾生物遺傳特性并創造生物新性狀的夢想。傳統環境微生物分析方法面臨的挑戰傳統微生物培養技術的現狀——微生物與現代分子生物學7/3/2023.基因改造后的工程菌野生菌株基因改造技術工程菌性能YarrowialipolyticaDC-3-2N+離子束注入誘變育種對油脂的降解率提高了11.09%Sphingomonassp.BHC-A轉座子介導同源重組獲得了降解有機磷農藥的功能Candidatropicalis

和Candidalipolytica電融合融合菌的耐pH及耐高濃度鉻的能力均優于親本菌工業用釀酒酵母HDY-01基因敲除乙醇產量降低，適于生產低醇啤酒Chaetomiumcupreum多點突變提高幾丁質酶的表達量Bacillusthuringiensis定點突變提高對農業害蟲甜菜夜蛾的毒力傳統環境微生物分析方法面臨的挑戰7/3/2023.傳統環境微生物分析方法面臨的挑戰

隨著現代分子生物學的發展，尤其是可以利用16SrRNA技術鑒定純培養物種的歸屬，大大豐富了我們所獲得的環境微生物種類及遺傳多樣性。從分子水平上對微生物進行基因研究，為探索微生物個體以及群體間作用的奧秘提供了新的線索和思路。

7/3/2023.

純培養技術使得研究者擺脫了多種微生物共存的復雜局面，從而能夠不受干擾地對單一菌落進行研究，確保了人類對微生物形態結構、生理和遺傳特性的認識。但是，隨著研究的不斷進行，這一技術暴露出巨大的局限性——平板計數異常(PlateCountanomaly)，即環境中微生物實際數量同平板菌落計數之間存在巨大差異。傳統環境微生物分析方法面臨的挑戰7/3/2023.造成平板計數異常的原因：由于實驗室難以再現微生物的自然生存條件大種群微生物易形成優勢種進而抑制了小種群的生長

傳統環境微生物分析方法面臨的挑戰

因此，利用傳統的純培養技術總是重復篩選到相同的微生物，而多數難以被常規實驗室方法培養的微生物被稱為未培養微生物或不可培養微生物(UnculturedMicroorganism)。7/3/2023.微生物的自然多樣性結構多樣性代謝多樣性行為多樣性進化多樣性生態多樣性傳統環境微生物分析方法面臨的挑戰土壤海洋腸道7/3/2023.傳統環境微生物分析方法面臨的挑戰

科學家根據現有的科學證據推測微生物種類數目應該在105-106。采用傳統微生物培養技術對不同生境微生物可培養性的驗證來看，海水中可培養的微生物約占0.001%-0.1%，淡水約占0.25%，土壤約占0.3%，活性污泥約占1%-15%左右。許多實驗室證實，有些微生物處于一種活的但不可培養(ViablebutNonculturable，VBNC)的狀態。據報道，至少有16個屬的30種細菌屬于此類微生物。

因此，純培養技術的局限性已經成為研究微生物自然生態和多樣性的主要瓶頸，這迫使我們不得不重新審視傳統的純培養技術。

7/3/2023.The‘omics’組學技術GenomeTranscriptomeProteomeMetabolome現代分子生物學技術現代環境微生物分析方法發展概述系統生物學7/3/2023.現代環境微生物分析方法發展概述組學技術在微生物群落結構解析方面的應用7/3/2023.現代環境微生物分析方法發展概述微生物非培養技術的產生與發展

微生物學家運用非培養方法來研究自然界中的微生物，即避開傳統的微生物分離培養方法，利用DNA含有不同的信息內容和信息容量這一特性，直接研究細胞的DNA以獲取自然界微生物的多樣性及群落組成的信息，及從分子生態學的角度研究未培養微生物在環境中的變化。非培養技術的主要任務在于：革命性地改變了人們對原核生物多樣性和自然界微生物群落組成的理解，并提供開發不可培養微生物資源的新途徑。

7/3/2023.微生物多樣性群落分析生物材料獲取

DNA-DNA復性

G+C含量分析DNA指紋分析直接PCR擴增宏基因組技術現代環境微生物分析方法發展概述非培養技術的分類7/3/2023.現代環境微生物分析方法發展概述

以群落分析為目的的非培養技術

大尺度的分析群落DNA的非培養法有DNA-DNA復性和G+C含量分析兩種方法，它們能分別給出所研究微生物群落總的基因多樣性和結構的改變。DNA指紋技術大尺度群落分析變性梯度凝膠電泳(DGGE)擴增rDNA限制性分析(ARDRA)末端限制性片段長度多態性(T-RFLP)核糖體基因間序列分析(RISA)7/3/2023.現代環境微生物分析方法發展概述以生物材料獲取為目的的非培養技術

1.基于目標瞄定的PCR直接擴增法，即不需知道基因的序列，僅根據保守序列設計引物，就可以直接從環境DNA中擴增到目的基因，該法方便、簡單、快速但不易獲得新型基因。2.宏基因組技術，即通過對環境DNA構建插入基因組文庫，并利用活性或序列篩選的方法以獲取目標基因的新技術。

宏基因組技術不僅可以將系統發育信息和未培養群落成員隱含的功能信息以及未被發現的有意義的新的功能基因聯系起來，而且還可用于共生關系或其他簡單群落中未培養群落的全基因組測序，有利于我們重新認識有意義但未被開發的生物學過程。

7/3/2023.現代環境微生物分析方法發展概述微生物非培養技術的優勢與局限性

微生物非培養技術的優越性

(1)發現新種(2)評價具有重要生態地位的種類(3)古菌的研究(4)菌種與環境功能的關聯

非培養技術也有其缺陷和偏差。比如，克隆文庫測序不完全，細胞裂解程度的不同、特定細胞DNA被優先擴增以及由PCR的循環步驟帶來的一些分析難題影響著克隆文庫的應用。7/3/2023.現代環境微生物分析方法發展概述微生物非培養技術的應用前景

(1)微生物多樣性程度的測定(2)生態學和進化(3)目標基因的獲取(4)非培養微生物特征的鑒定(5)系統水平理解微生物群落動力學7/3/2023.rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析

研究DNA多態性的最直接、有效的途徑就是測定DNA的序列，但測序是一項極為復雜和艱難的工作，同時也需要昂貴的設備。目前，在針對微生物研究的DNA指紋技術中，最常見的靶基因是16SrDNA和核糖體DNA的基因間隔區(InternalTranscribedSpacer，ITS)。細菌的rRNA組成7/3/2023.

細菌的23SrDNA、16SrDNA和5SrDNA分別含有約為2900個、1540個和120個呈現不同堿基對排列的核苷酸。rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析CarlWoese上世紀60年代末，Woese開始采用寡核苷酸編目法對生物進行分類，他通過比較各類生物細胞的rDNA特征序列，認為16SrDNA及其類似的rDNA基因序列作為生物系統發育指標最為合適。7/3/2023.rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析rDNA序列的微生物鑒定主要依據為：rDNA是生物體細胞中必要的成分，具有功能同源性且最為古老，而且同時含有保守序列和可變序列，分子大小適合操作，它的序列變化與進化距離相適應等。

7/3/2023.

用于一些DNA指紋分析方法（如DGGE/TGGE）的引物主要是針對16SrDNA為靶基因的引物，通過它的分析可以直接鑒定到屬或種。根據核糖體16SrDNA結構變化規律，在所測定的區域中包括了V1、V2、V3、……、V8共8個高變區，尤其是V3這一高變區，由于其進化速度相對較快，其中所包含的信息足夠用于物種屬及屬以上分類單位的比較分析。常用引物包括341F/534R（V3區）、968F/1401R（V6-V8區）、63F/534R（V1-V3區）、341F/926R（V3-V5區）等。

rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析16SrDNA7/3/2023.常用16SrDNA序列引物引物序列（5’→3’）應用范圍27fAGAGTTTGATCNTGGCTCAGPCR測序、多數真細菌109r1ACGYGTTACKCACCCGT廣泛特異性109r2AKRCATTACTCACCCGT多數γ-紫細菌和一些β-紫細菌342rCTGCTGCSYCCCGTAG多數真細菌357rCTCCTACGGGAGGCAGCAG多數真細菌519rGWATTACCGCGGCKGCTG多數真細菌、真核生物、古菌530rGTGCCAGCMGCCGCGG多數真細菌、真核生物、古菌685r1TCTACGRATTTCACCYCTACα-紫細菌、δ-紫細菌、梭菌屬685r2TCTACGCATTTCACYGCTACα-紫細菌、γ-紫細菌685r3TCTRCGCATTYCACCGCTAC多數G+、藍細菌、混雜細菌907rCCGTCAATTCMTTTRAGTTT多數真細菌、真核生物、古菌926fAAACTYAAAKGAATTGACGG多數真細菌、真核生物、古菌1100rGGGTTGCGCTCGTTG多數真細菌1114fGCAACGAGCGCAACCC多數真細菌1392rACGGGCGGTGTGTRC多數真細菌、真核生物、古菌1406fTGYACACACCTCCCGT多數真細菌、真核生物、古菌1492rTACGGYTACCTTGTTACGACTT測序多數真細菌、古菌1525rAAGGAGGTGWTCCARCC測序多數真細菌、古菌注：M=C或A，Y=C、A或T，K=G或T，R=A或G，S=G或C，W=A或T。7/3/2023.

1980年，Brosius等利用23SrRNA基因序列測定的方法推導出大腸桿菌23SrRNA的全部核苷酸排列順序，整個分子含有2904個核苷酸。1981年相繼有三個實驗室提出了大腸桿菌23SrRNA的二級結構模型。目前已經獲得了大量有關23SrRNA基因序列的信息，不同來源的23SrRNA約有60%~70%的結構共同性。大腸桿菌23SrRNA的一級結構與酵母也有很大相似性。雖然已有大量的大腸桿菌23SrRNA基因序列信息，但是相比于16SrRNA基因序列信息要少得多，因此在微生物分析中還沒有得到廣泛的應用。rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析23SrDNA

7/3/2023.rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析核糖體DNA的基因間隔區(ITS區)

細菌的rDNA通常由5S、16S和23S及一些間隔序列組成。近十幾年來，人們成功的以核糖體大小亞基基因間的間隔序列為對象，對細菌進行更細致的分類和鑒定，并對細菌群落的結構和多樣性進行分析。

核糖體DNA的基因間隔區示意圖7/3/2023.PCR擴增技術的應用

PCR擴增原理示意圖（左）及PCR儀工作原理曲線（右）

DNA指紋技術通常需要大量的DNA片段，因此，需要一種手段能夠同比例的放大混合DNA樣品的量。聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，PCR）通過試管中進行的DNA復制反應使極少量的基因組DNA或RNA樣品中的特定基因片段在短短幾小時內擴增幾百萬倍。7/3/2023.不同種類的PCR方法方法名稱基本原理適用范圍特點巢式PCR利用兩套PCR引物（巢式引物）對DNA模板進行兩輪PCR擴增反應。一般應用于動物方面，如：病毒、梅毒螺旋體、HIV、腫瘤基因的檢測等。降低了擴增多個靶位點的可能性，增加了檢測的敏感性及檢測的可靠性。反向PCR用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段。僅知部分序列的全長cDNA的克隆，曾被用于擴增基因文庫的插入DNA。簡單快速，可以研究許多獨立克隆。對條件要求較高，需優化。原位PCR在不破壞細胞的前提下利用原位的完整細胞作為一個微反應體系來擴增細胞內的靶片斷的方法，是一種把PCR和原位雜交結合起來的新方法。可應用于多種類型的研究材料（組織切片、離心細胞、懸浮細胞等）的不同拷貝數目序列（病毒的或基因組的DNA或RNA）的擴增。既有高度的敏感性，又有精確的定位。定量PCR主要利用加入PCR反應體系中的熒光基團或熒光染料來對擴增產物進行連續檢測，最后通過標準曲線對未知模板濃度進行定量分析。已成功運用于水資源及居家辦公環境中的大腸桿菌、藻青菌和一些寄生蟲的檢測；轉基因生物鑒定和生物種類鑒定等方面。實時監測、定量準確、靈敏度高、反應后不用電泳檢測等。反轉錄PCR先用寡聚胸苷作為引物在逆轉錄酶作用下，反轉錄所有mRNA成cDNA，再用擬擴增片段兩端的兩段引物PCR擴增該段cDNA的方法。對表達信息進行檢測或定量分析；測定基因表達的強度；鑒定已轉錄序列是否發生突變及呈現多態性等。快速靈敏。多重PCR在一個反應管中使用多套引物，針對多個DNA模板或同一模板的不同區域進行擴增的方法。各類病原的檢測與鑒別、遺傳疾病診斷、以及基因缺失、突變和多態性分析等。能夠同時檢測多種目的DNA，節省樣品，操作簡單。但對條件要求較高，需優化。熱不對稱交錯PCR利用目標序列旁的已知序列設計3個嵌套的特異性引物，用它們分別和1個具有低Tm值的短的隨機簡并引物相組合，根據引物的長短和特異性的差異設計不對稱的溫度循環，通過分級反應來擴增特異引物。用于分離獲得克隆載體上的DNA序列，也能夠用于基因組小的物種如擬南芥、水稻和基因組大的物種，如小麥以及哺乳動物的已知序列兩側翼的DNA序列的分離。操作簡單，特異性高，高效靈敏，快速，不涉及連接反應，反應產物準確可靠，重復性好。但其需要的組合較多，而且有時存在假陽性。7/3/2023.巢式PCR技術

巢式PCR原理示意圖巢式PCR(nestedPCR)，是指利用兩套PCR引物(巢式引物)對DNA模板進行兩輪PCR擴增反應。7/3/2023.反向PCR技術反向PCR的原理示意圖常規PCR是擴增兩引物之間的DNA片段，反向PCR（reversePCR）是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段。7/3/2023.原位PCR技術

原位PCR可應用于多種類型的研究材料（組織切片、離心細胞、懸浮細胞等）不同拷貝數目的序列（病毒的或基因組的DNA或RNA），擴增方法可分為單個或多個引物對，檢測系統也分為直接和間接兩種。原位PCR的大致流程主要包括：染色體、細胞及組織切片樣品的制備PCR前處理，包括石蠟切片、去石蠟、染色體變性和細胞穿透PCR擴增，一般采用熱啟動PCR，病毒RNA的擴增需用反轉錄PCRd.原位雜交及檢測。7/3/2023.定量PCR技術

定量PCR技術的方法主要包括：PCR產物的直接定量、有限稀釋法、外對照PCR定量、內對照PCR定量、競爭性PCR定量以及熒光定量PCR。其中又以實時熒光定量PCR（RealtimeFluorescentQuantitativePCR，RFQ-PCR）的方法應用最為廣泛。

7/3/2023.實時熒光定量PCR的兩種定量技術原理定量PCR技術

實時熒光定量PCR的動態變化圖（左）和標準曲線圖（右）7/3/2023.反轉錄PCR技術

反轉錄PCR（ReversedTranscriptPCR，RT-PCR），是一種將cDNA合成與PCR技術結合，用以分析基因表達的快速、靈敏的方法。

反轉錄PCR原理示意圖7/3/2023.熱不對稱交錯PCR技術

熱不對稱交錯PCR（ThermalAsymmetricInterlacedPCR，簡稱TAIL-PCR）是一種用來分離與已知序列鄰近的未知DNA序列的分子生物學技術。TAIL-PCR反應流程7/3/2023.核酸探針雜交技術的應用

分子雜交技術(techniqueofmolecularhybridization)又稱核酸雜交技術，是利用現代分子生物學技術手段從分子水平探討組織細胞內特定基因的表達變化規律，并闡明細胞功能調節機制的一種極為重要的方法，在一定程度上具有其他生物檢測技術所不能替代的作用。7/3/2023.常規分子雜交技術的定義及分類菌落原位雜交分子雜交技術常規分子雜交技術熒光原位雜交技術生物芯片技術固相雜交液相雜交斑點雜交Southern印跡雜交Northern印跡雜交組織原位雜交夾心雜交DNA斑點雜交RNA斑點雜交完整細胞斑點雜交吸附雜交發光液相雜交液相夾心雜交復性速率液相分子雜交HAP吸附雜交親和吸附雜交磁珠吸附雜交能量傳遞法吖啶翁酯標記法親和雜交采用多組合探針和化學發光檢測基因芯片蛋白質芯片芯片實驗室其他類型生物芯片cDNA微陣列芯片寡核苷酸芯片技術組織芯片細胞芯片糖芯片7/3/2023.菌落原位雜交

菌落原位雜交是將細菌從培養平板轉移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂解以釋出DNA與探針進行雜交反應的方法。用菌落原位雜交方法進行的FASTPlaqueTB實驗7/3/2023.Southern印跡Southern印跡雜交的操作流程7/3/2023.熒光原位雜交技術原位雜交(InSituHybridization，ISH)技術是用標記的核酸探針，使用非放射檢測系統或放射自顯影系統，在組織切片、細胞涂片及染色體制片上等對核酸進行定性、定位和相對定量研究的一種分子生物學方法，具有靈敏、特異、直觀等優點。

ANAMMOX污泥中浮霉狀細菌熒光原位雜交分析7/3/2023.熒光原位雜交技術

熒光原位雜交技術的基本原理是基于堿基互補的原則，用熒光素標記的已知外源DNA或RNA作探針，與待檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA相互補的核酸探針進行染色體水平上的原位雜交，通過檢測雜交位點熒光來顯示特定核苷酸序列的存在、數目和定位。

樣品的固定樣品的制備和預處理預雜交探針和樣品變性用不同的探針雜交以監測不同的靶序列漂洗去除未結合的探針雜交信號的檢測和結果分析FISH技術具體步驟7/3/2023.熒光原位雜交技術將中期細胞固定于玻片上將DNA變性成單鏈雙鏈DNA探針熒光標記探針變性成單鏈探針與靶DNA雜交熒光檢測圖像獲取和分析mFISH技術的實驗路線圖7/3/2023.熒光原位雜交技術利用熒光原位雜交技術觀測鐵沉積樣品中的微生物群落結構7/3/2023.生物芯片技術

生物芯片是指通過微加工和微電子技術在固相基質表面構建微型生物化學分析系統，以實現對細胞及蛋白質、核酸等生物分子進行準確、快速、高通量檢測。生物芯片的本質特征是利用微電子、微機械、化學、物理以及計算機技術，將生命科學研究中的樣品檢測、分析過程實現連續化、集成化、微型化。

生物芯片各部分高度整合7/3/2023.生物芯片技術生物芯片新技術及其優點核酸芯片相關的新技術優點長鏈探針技術特異性和靈敏度較高凝膠微陣列芯片技術固定探針能力強，探針分子更易于與目標分子反應，生物兼容性好侵入式探針技術操作簡便，恒溫反應，費用低，準確性高，易于自動化和高通量操作捕獲探針技術靈敏度高，分析時間較短，成本較低固相引物延伸技術靈敏度較高，易于高通量操作電子生物芯片反應效率較高，特異性較好LNA技術雜交特異性較好，生物學穩定性較高PNA技術更好的結合能力和更高的特異性7/3/2023.生物芯片技術基因芯片技術的原理7/3/2023.生物芯片技術cDNA微陣列芯片原理圖7/3/2023.生物芯片技術核酸編程的蛋白質芯片制備原理7/3/2023.DNA指紋圖譜技術DNA指紋技術包括：變性梯度凝膠電泳（DGGE）溫度梯度凝膠電泳（TGGE）單鏈構象多態性分析（SSCP）限制性片段長度多態性分析（RFLP）末端限制性片段長度多態性分析（T-RFLP）核糖體基因間隔序列分析（RISA）擴增的rDNA限制酶切分析技術（ARDRA）隨機擴增多態性DNA分析（RAPD）

7/3/2023.DNA指紋圖譜技術總DNA的提取、純化與檢測PCR擴增及限制性內切酶酶切PCR擴增產物（或其酶切產物）的分離圖譜解析及數據分析等DNA指紋圖譜的建立過程示意圖總DNA提取流程示意圖7/3/2023.匹配指紋技術的電泳技術

分類依據名稱應用分離對象蛋白質電泳研究蛋白質的理化性質及免疫學特征核酸電泳分離、鑒定及制備純化核酸支持物瓊脂糖凝膠電泳（圖6-15a）分離、鑒定核酸及蛋白質聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳（圖6-15b）分離、鑒定蛋白質及核酸醋酸纖維膜電泳分離、鑒定蛋白質自由溶液電泳分離、鑒定蛋白質及核酸電泳機理等電聚焦電泳分離、鑒定蛋白質，測定蛋白質等電點十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS）凝膠電泳（圖6-15c）分離、鑒定蛋白質，測定蛋白質分子量雙向電泳分離、鑒定蛋白質及細胞蛋白組成脈沖場電泳分離、鑒定及大病毒DNA免疫電泳分析、鑒定蛋白質的免疫學性質其它轉印電泳蛋白質的免疫學分析及核酸的分子雜交鑒定毛細管電泳分離鑒定蛋白質、多肽、核苷酸、核酸及小分子化合物7/3/2023.DNA指紋圖譜技術瓊脂糖凝膠電泳示意圖7/3/2023.DNA指紋圖譜技術聚丙烯酰胺電泳示意圖7/3/2023.常見DNA指紋技術的比較方法名稱基本原理基本步驟特點變性梯度凝膠電泳（DGGE）利用在堿基序列上存在差異的不同DNA雙鏈解鏈時需要不同的變性劑濃度，進而導致DNA雙鏈遷移速度的不同，將不同序列DNA片段分開，從而產生不同的指紋圖譜。①樣品總DNA提取及純化；②樣品16SrDNA片段的PCR擴增；③預實驗，對化學變性劑濃度范圍進行確定；④樣品的DGGE分析。具有重現性強、可靠性高、速度快等優點，但該項技術具有對樣品預處理過程要求較高、操作較為繁瑣等局限性。溫度梯度凝膠電泳（TGGE）TGGE技術的基本原理與DGGE技術相似，變性條件由不同濃度梯度的變性劑變成溫度梯度。①樣品總DNA提取及純化；②樣品16SrDNA片段的PCR擴增；③預實驗，對化學變性劑濃度范圍進行確定；④樣品的DGGE分析。具有重現性強、可靠性高、速度快等優點，但該項技術具有對樣品預處理過程要求較高、操作較為繁瑣等局限性。單鏈構象多態性分析（SSCP）相同長度的DNA單鏈因其順序不同，甚至單個堿基不同，所形成的構象不同，因而電泳遷移率不同而在凝膠中被分開，產生指紋圖譜。①樣品總DNA提取及純化；②樣品靶基因片段的PCR擴增；③非變性聚丙烯酸胺凝膠電泳分離。具有操作簡單；周期短；成本較低等特點，適合于大樣本篩查等。擴增片段長度多態性分析（AFLP）對基因組酶切片段的選擇性擴增，將獲得的擴增片段通過瓊脂糖凝膠或變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測，根據帶型中一些特征條帶的出現或消失，檢測出不同擴增片段長度的多態性。①樣品總DNA提取及純化；②雙酶切及連接；③PCR預擴增；④PCR選擇性擴增；⑤變性聚丙烯酰膠胺凝膠電泳。具有效率、分辨率高；重復性好；操作簡便；樣品用量少、適用性廣等特點。但存在技術費用昂貴、對模板反應遲鈍、在對等位基因的精確定位等方面存在一定的局限性。末端限制性片段長度多態性分析（T-RFLP）微生物群落中任何具有特異性的DNA片段都可以作為目標分析序列，包括微生物核糖體小亞基（SSU）16SrRNA（原核生物）和18SrRNA（真核生物）的基因序列，以及一些保守的功能基因序列等。通過對特定核酸片段長度多態性的測定來分析微生物群落結構和功能。①樣品總DNA的提取；②PCR擴增③PCR擴增產物的限制性酶切；④變性聚丙烯酸胺凝膠電泳分離。具有分辨率高、易于實現自動化等特點。但存在PCR差異性、無法準確的分析較大量生物信息等局限性。7/3/2023.常見DNA指紋技術的比較核糖體基因間隔序列分析（RISA）細菌16S和23SrDNA間隔片段（ITS）的大小可因不同的物種而變化，利用PCR將ITS擴增出來，并利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，即可產生RISA指紋圖譜。①樣品總DNA的提取；②ITS序列的PCR擴增；③用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR擴增產物及解析圖譜。具有簡單經濟；易操作等特點。但同時存在精度較差等缺點。擴增的rDNA限制酶切分析技術（ARDRA）一定長度的DNA經某種限制性內切酶消化后，產生若干不同長度的小片段，其數量和每一片斷長度反映了DNA上該限制性內切酶酶切位點的分布。這些不同的片斷經瓊脂糖凝膠電泳分離后，根據其顯示的帶型，可以判斷樣品間的差異。①樣品總DNA提取及純化；②PCR擴增；③限制性酶切；④用低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離酶切的DNA片段并解析圖譜。具有特異性強、效率高的特點。隨機擴增多態性DNA分析（RAPD）利用一系列隨機引物，以DNA為模板，通過基因放大器進行多態性DNA片段的隨機合成。①樣品總DNA提取及純化；②隨機性PCR擴增；③用低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物并解析圖譜。具有效率高、特異性強、樣品用量少以及檢測容易等特點。擴增功能DNA限制性分析（AFDRA）對基因組中功能基因的選擇性擴增，利用限制性內切酶對功能基因進行酶切，后利用瓊脂糖凝膠電泳分離得到酶切片段多樣性圖譜，以判斷功能基因的多樣性。①樣品總DNA提取及純化；②利用設計的特異性引物對功能基因進行PCR擴增；③限制性酶切；④用含有Nusieve（FMC的生物產物）的瓊脂糖凝膠矩陣分離酶切的DNA片段并解析圖譜。專用于功能基因多樣性的分析，具有效率高、特異性強、檢測靈敏度高等特點。但引物的設計對結果影響較大，預實驗較為繁瑣。7/3/2023.DNA指紋圖譜技術變性梯度凝膠電泳(DGGE)DGGE的原理是：在堿基序列上存在差異的不同DNA雙鏈解鏈時需要不同的變性劑濃度，DNA雙鏈一旦解鏈，其在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度將會急劇下降，因此，將PCR擴增得到的等長DNA片段加入到含有變性劑梯度的凝膠中進行電泳，序列不同的DNA片段就會在各自相應的變性劑濃度下變性，發生空間構型的變化，導致電泳速度的急劇下降，以至停留在其相應的變性劑梯度位置，染色后可以在凝膠上呈現為分開的條帶，每個條帶代表一個特定序列的DNA片段。在不同泳道中停留在相同位置的條帶，一般可視為具有相同序列的DNA。

7/3/2023.DNA指紋圖譜技術不同偶氮染料脫色菌群的DGGE指紋分析圖譜7/3/2023.溫度梯度凝膠電泳(TGGE)DNA指紋圖譜技術TGGE技術的基本原理與DGGE技術相似，含有高濃度甲醛