研制具有較高免疫保護(hù)作用的SjserpinDNA疫苗

立項(xiàng)依據(jù)目前我國(guó)仍有108個(gè)縣有血吸蟲(chóng)病流行，69.5萬(wàn)人感染血吸蟲(chóng)病，并且隨著近年來(lái)長(zhǎng)江洪水泛濫和退耕還湖又有重新升高的趨勢(shì)[1]。多年來(lái)，控制血吸蟲(chóng)病以化療為主．輔以易感地帶滅螺的綜合性防治措施，取得較好的效果。但由于在流行區(qū)化療停止后再感染迅速出現(xiàn)和長(zhǎng)期、反復(fù)、大規(guī)模使用吡喹酮化療，血吸蟲(chóng)對(duì)吡喹酮的潛在耐藥性，迫切需要發(fā)展血吸蟲(chóng)疫苗以補(bǔ)充血吸蟲(chóng)病的防治措施[2]。DNA疫苗作為一種新型的疫苗，已在包括寄生蟲(chóng)感染在內(nèi)的多個(gè)領(lǐng)域內(nèi)開(kāi)展了廣泛研究[3]．但是現(xiàn)行的酶抗原，血吸蟲(chóng)肌球蛋白組抗原，血吸蟲(chóng)膜相關(guān)蛋白，血吸蟲(chóng)鈣相關(guān)蛋白，血吸蟲(chóng)線粒體相關(guān)蛋白和信號(hào)蛋白，血吸蟲(chóng)性別相關(guān)蛋白等制作出的DNA疫苗的免疫保護(hù)效果僅有小幅增加[4]。最新研究表明，來(lái)自哺乳動(dòng)物內(nèi)部的消化酶：胰蛋白酶和胰彈性蛋白酶(PE)很容易被抑制[5],以纖溶酶原激活物抑制因子2為代表了一種細(xì)胞抑制劑（serpin）可以通過(guò)一種獨(dú)立的途徑（不經(jīng)過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體）分泌到細(xì)胞外[6]。據(jù)文獻(xiàn)[7]報(bào)道多房棘球絳蟲(chóng)六鉤蚴入侵人體階段，分泌的serpin，能夠阻斷宿主消化酶的酶解攻擊，這樣，Sjserpin就可以在免疫系統(tǒng)做為一個(gè)靶位，引發(fā)免疫反應(yīng)[8]。因此，本實(shí)驗(yàn)將能夠表達(dá)serpin的血吸蟲(chóng)的一段cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制作出SjserpinDNA疫苗，并對(duì)小鼠保護(hù)性免疫進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而為人類血吸蟲(chóng)防治提供新思路。

實(shí)驗(yàn)摘要提取全長(zhǎng)的日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株絲氨酸蛋白酶抑制劑(Sjserpin)基因，并將其克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1，構(gòu)建DNA疫苗

pcDNA3.1—serpin；制備SjserpinDNA疫苗和對(duì)照pcDNA3.1。將20只BALB/c小鼠隨機(jī)分為A、B2組。A組小鼠肌注100ugpcDNA3.1；B組注射100ugpcDNA3.l-Sjserpin。每隔2周各免疫1次，共3次。第8周每鼠感染30±2條／只尾蚴，45d后剖殺，計(jì)數(shù)成蟲(chóng)及肝內(nèi)蟲(chóng)卵。采用免疫組化法檢測(cè)局部組織中Sjserpin的表達(dá)；用脾細(xì)胞培養(yǎng)法檢測(cè)經(jīng)Sjserpin刺激后．攻擊前、后小鼠脾細(xì)胞IL-2,IL-4,IL-10和IFN-r的水平。用ELISA檢測(cè)血清中抗Sjserpin抗體。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容動(dòng)物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)2DNA疫苗pcDNA3.1-Sjserpin的制備1研究SjserpinDNA疫苗作用機(jī)制

3

數(shù)據(jù)處理4

實(shí)驗(yàn)方法步驟

1.1

1.1引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)Sjserpin的基因序列設(shè)計(jì)兩條引物P1和P2，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，分別在Pl和P2的5'端引入BamHI和Xhol的酶切位點(diǎn)。以日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)cDNA文庫(kù)為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1.DNA疫苗pcDNA3.1-Sjserpin的制備Sjserpin亞克隆入pcDNA3.1

1.2

將PCR產(chǎn)物與T載體pMD18-T連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，培養(yǎng)提取Sjserpin，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物Sjserpin再與pcDNA3.1連接，用同樣方法得到重組質(zhì)粒[9]。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，作DNA測(cè)序進(jìn)一步確認(rèn)。

1.3

DNA疫苗pcDNA3.1，pcDNA3.1-Sjserpin的制備按說(shuō)明書(shū)用大規(guī)模質(zhì)粒純化試劑盒Qiagen2500大量制備，制得的質(zhì)粒。DNA溶解于無(wú)菌的生理鹽水(0.9％)中．在核酸蛋白測(cè)定儀上測(cè)定OD值，計(jì)算DNA濃度。

2.動(dòng)物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)將20只小鼠隨機(jī)分為A，B2組，每組10只。A組(pcDNA3.1組)經(jīng)小鼠股四頭肌注射100ugpcDNA3.1質(zhì)粒DNA；B組(Sjserpin組)注射100ugpcDNA3.l-sjserpin質(zhì)粒DNA。分別于第0、2、4周各免疫接種一次（劑量和方法相同)．于第8周每鼠以30+/-2條／只尾蚴用腹部貼片法攻擊感染，攻擊后45d剖殺小鼠收集成蟲(chóng)計(jì)數(shù)，取出肝臟稱重后用5％KOH37℃消化過(guò)夜，進(jìn)行蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)。按公式：減蟲(chóng)率=(對(duì)照組平均每鼠成蟲(chóng)數(shù)-實(shí)驗(yàn)組平均每鼠成蟲(chóng)數(shù))／對(duì)照組平均每鼠成蟲(chóng)數(shù)×100％．減卵率=(對(duì)照組平均每鼠蟲(chóng)卵數(shù)一實(shí)驗(yàn)組平均每鼠蟲(chóng)卵數(shù))/對(duì)照組平均每鼠蟲(chóng)卵數(shù)×100％．計(jì)算減蟲(chóng)率及減卵率。

3.1

3.研究SjserpinDNA疫苗作用機(jī)制

Sjserpin在小鼠局部肌肉組織內(nèi)的表達(dá)每組各取2只小鼠在第一次免疫后10d再以同劑量加強(qiáng)免疫一次，4d后剖殺小鼠，取兩腿股四頭肌做冰凍切片，Sjserpin的組化檢測(cè)首先在每張冰凍切片上加入日本血吸蟲(chóng)重感染兔血清．4℃過(guò)夜后加二抗羊抗兔IgG-HRP，反應(yīng)后經(jīng)DAB顯色，顯微鏡下觀測(cè)結(jié)果。3.2

細(xì)胞迅因子鍬檢測(cè)訪談寒結(jié)果藝與析雙抗反體夾次心法分別鈴于攻獎(jiǎng)?chuàng)羟敖K后2周每限組各樹(shù)取兩女只小帽鼠拉單頸處薯死，躲取出循脾臟慌，常尾規(guī)法幣制備昌單個(gè)倉(cāng)脾細(xì)豎胞懸眼液，寺用10％FC液S蒼RP逢MI動(dòng)1花64敞0完全盛培養(yǎng)豆液調(diào)蛙整細(xì)氧胞濃美度為6*和10唉^3個(gè)／ml，每贈(zèng)孔加宴入10景0u蒸l脾細(xì)射胞。級(jí)每組仆分別撥用10災(zāi)0C斗on塞A(愉10徐ug／ml組)和se兩rp診in趕(1魚(yú)0蠶ug／m1臘)進(jìn)行州刺激融。空炕白孔球加找入10紗0u花l欣10％FC今S略RP鞏MI粒1蜻64壺0，于5％CO械23轉(zhuǎn)7℃培養(yǎng)72杯h(huán)，離征心收另集上留清進(jìn)萬(wàn)行細(xì)脹胞因糠子檢權(quán)測(cè)。鋼細(xì)胞覆因子裁檢測(cè)摔按說(shuō)忌明書(shū)摔采用店雙抗順體夾澇心法塌。3.3

抗體鵝檢測(cè)攻擊匠前2揚(yáng)周各匪組分該別取6份血游清、四攻擊亞后各滴組取6份血供清．績(jī)用E頭LI露SA紫法檢馬測(cè)血膛清中螺的S哈js共er斤pi忙n抗旋體。4數(shù)據(jù)處理減蟲(chóng)賭均數(shù)睜和減則卵均暴數(shù)數(shù)軋據(jù)用歸均數(shù)+-標(biāo)準(zhǔn)夫差表設(shè)示，什用SP滑SS掠10櫻.0統(tǒng)計(jì)厚軟件鏟對(duì)數(shù)國(guó)據(jù)進(jìn)槍行On蹤蝶e-暮wa敬y掏AN緣瑞OV禽A分析暑，P<認(rèn)0.櫻05表示岔差異螺在統(tǒng)睡計(jì)學(xué)脂上有援顯著戶性[1捏0]統(tǒng)計(jì)象學(xué)處勸理參考文獻(xiàn)[1點(diǎn)]．陳隱賢義判．姜硬慶五早，趙乒根明抵．等20純00年全拌國(guó)血?dú)v吸蟲(chóng)斜疫情低通報(bào)右，中洞國(guó)血挽吸蟲(chóng)許病防創(chuàng)治雜吸志，20分00．13：12規(guī)9-斜13寨1.[2峰].災(zāi)Mc景Ma市nu鵲s漢DP來(lái).A枯v敞ac霞ci桂nc丘a從ga胖in層st驢A坐si貨a等sc襯hi芒st閱os冶on頭na澆si符s:摔ti壇cc吉s敲to劣ry跳a充nd望u貨nf亞ol嫌ds菜,席In再t帥J肝Pa嗎ra特si宰to種l哪.州2縱00桶0，30：26化5—民27兆l.[3心]．Ra殊ms樣ay罵A酷J.王Ra墨ms氏ha模w趴LA凡,莖A叮da汁G憑L比.e植ta慣l.奧D我NA貫1煮99業(yè)7．75：36否0珠36景5.[4推].曹建左平，滴李小勿紅，刺劉述蜘先泰我國(guó)集血吸調(diào)蟲(chóng)疫纏苗研絹究進(jìn)孩展和鵲展望銳，中朝國(guó)傳鋸染病伐雜志焦，20霉05絕.1吵2第23卷第遲六期.[5晃].碑Ar抱mi產(chǎn)n豪Me犧r(nóng)c本ke蜂lb殊ac洪h窯,巨An俗dr絲式ea授s慚Ru亂pp荒el浮B積io丑ch助em旺ic趕al嚇p花ro物pe握rt低ie御s晌of普a通n權(quán)in欺tr驅(qū)ac淡el剪lu刊la著r置se紙rp何in已f范ro扒m猶Ec創(chuàng)hi刺no逗co周cc退us蒼m挖ul味ti咐lo餃cu寄la見(jiàn)ri距s.里15補(bǔ)6倒(2搜00貌7)蜻8味4–供88雨.[6滲].晌Ri單tc欲hi淘e因H,違B付oo索th陳N塞A.所S熱ec可re共ti獸on頑o娃f跨pl蠟as推mi礎(chǔ)no襲ge通n昏ac勤ti棒va擦to邀r缺in駛hi置bi摩to潔r丑2經(jīng)by絲式h隸um紗an虜p父er清ip葡he悼ra耍l斥bl狠oo鋼d趁mo曉no增cy秧te殺s萍o(jì)c暑cu伏rs濫v彩ia杰a鼠n購(gòu)en把do出pl衡as睛mi支c性re乏ti亡cu菌lu般mg團(tuán)ol呀gi叛-i嗓nd漏ep稍en聰de擾nt譯p斬at識(shí)hw扮ay往.寬Ex牌p銀Ce迎ll廊R漠es洞1備99叫8;肅24蹈2:街43留9–喝50路.[7無(wú)].均Pr傻ev獻(xiàn)ot銜P幅P,或A貪da腳m眠B,峽Z勉ou劃ao短ui膠B市ou妻dj膊el雁ti競(jìng)a袍K,叔e(cuò)爽t猶al顛.外An刺ti跨-h劫ae夜mo盤(pán)st聰at靈ic滋e須ff互ec密ts貢o小f流a稠se這rp腫in雞f峽ro階m陣th注e厲sa止li狀va牢o置f妨th灘e屑ti瘡ck倚I微xo航de砍s厚ri伐ci茄nu暗s.洽J拒B改io妨l眠Ch轟em在2蜘00奪6;彈28肥1:躺26飼36逼1–斯9.[8袋].雀Ar攔mi咸n旱Me質(zhì)rc尖ke擱lb蔬ac肯h爽,溜An桌dr愈ea忘s趕Ru奶pp可el醒B具io扎ch螞em如ic撐al友p高ro噸pe姿rt李ie會(huì)s幸of塊a現(xiàn)n稠in端tr蹤蝶ac赴el夢(mèng)lu晃la乘r奔se鐮rp熱in序f培ro換m粒Ec膀hi聞no部co畢cc臉us論m疾ul張ti旱lo律cu欣la終ri唉s.有15倦6宮(2棵00木7)貴8哥4–嶄88震.[9弟].王陽(yáng)替陽(yáng)，帥劉淼溜，朱償紹春茂等某日本趕血吸棵蟲(chóng)表撒膜蛋臥白Te蠢tr絲式as碌pa宇ni坊n講2-葉A基因俯的克而隆、撐表達(dá)矮與鑒揭定撓中國(guó)并寄生凍蟲(chóng)學(xué)徐與寄獲生蟲(chóng)粗病雜姜志20吵08悠.2第26卷第晶一期[1畜0]賀.汪世觸平，心高冬這梅，處何卓哭，余嫂路新職等辰日本延血吸涉蟲(chóng)核攀糖體也蛋白Sj且RP衰S4、Sj直RP酬L7們D菊NA疫苗言對(duì)小付鼠免慰疫保帆護(hù)作漲用研顛究10戰(zhàn)02氧—2飲69或4(巷20招10毛)0緒2—羞00欄97弟—0濤4.本項(xiàng)乖目創(chuàng)猾新之騎處首先撈，DN洋A疫苗詞疫苗意做為挎第三易代疫絲式苗廣杰泛被禍人研塞究，胸它與預(yù)傳統(tǒng)趨的疫北苗相趨比有伐許多橡優(yōu)點(diǎn)吸：①蓋安全糟可靠噴，其蘿生產(chǎn)導(dǎo)過(guò)程安中不炭需要舅大量穗病原歷體的柏培養(yǎng)云，無(wú)績(jī)減毒么活疫鏟苗可裕能引投起的哲致病塊作用東；②壺更為受有效申，可束引起徑細(xì)胞容免疫孕及體蒼液免明疫反草應(yīng)；向③制篩備簡(jiǎn)桐便，騾只需摧要對(duì)蟻編碼奴抗原撞的基篩因進(jìn)議行設(shè)性計(jì)和除克隆稈，不儀需要嗓在體減外表蟲(chóng)達(dá)和倚純化躺蛋白賺；④搞價(jià)格盡低廉竭、使路用劑趕量低固、便靜于運(yùn)絕輸保紐奉存、濁易于北構(gòu)建兵和大灑規(guī)模恢生產(chǎn)槐；⑤D