1，25羥化維生素D3對(duì)人高轉(zhuǎn)移巨細(xì)胞肺癌PGCL3細(xì)胞侵襲、遷移和粘附能力的影響

【摘要】目的探討1，25羥化維生素D3對(duì)人高轉(zhuǎn)移巨細(xì)胞肺癌PGCL3細(xì)胞粘附、侵襲和遷移能力的影響。方法MTT法檢測(cè)其對(duì)PGCL3細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；分別用粘附相關(guān)基底膜成分分析實(shí)驗(yàn)、重組基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)、Transwell室趨化運(yùn)動(dòng)模型研究骨化三醇對(duì)PGCL3細(xì)胞的粘附、侵襲和運(yùn)動(dòng)能力的影響。結(jié)果骨化三醇明顯抑制PGCL3細(xì)胞的生長(zhǎng)。骨化三醇作用PGCL3細(xì)胞24h的IC50值為μmol/L。骨化三醇、、μmol/L處理PGCL3細(xì)胞24h，對(duì)PGCL3細(xì)胞侵襲能力的抑制率分別為%、%、%，對(duì)PGCL3細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的抑制率分別為%、%、%。降低PGCL3細(xì)胞對(duì)層粘連蛋白、纖維粘連蛋白的粘附率，且其效果呈一定的劑量依賴關(guān)系。結(jié)論骨化三醇抑制人高轉(zhuǎn)移巨細(xì)胞肺癌PGCL3細(xì)胞的粘附、侵襲和遷移能力；骨化三醇對(duì)PGCL3細(xì)胞粘附和侵襲的影響與其降低PGCL3細(xì)胞對(duì)層粘連蛋白、纖維粘連蛋白的粘附率有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】1，25羥化維生素D3；粘附；侵襲;遷移；人高轉(zhuǎn)移巨細(xì)胞肺癌PGCL3細(xì)胞

【Abstract】ObjectiveThisstudywasdesignedtoinvestigatetheeffectsof1，25-dihydroxyvitaminD3onadhesion，invasionandmigrationofPGCL3CellgrowinhibitionwasmeasuredbyMTTassay.Theeffectsof1，252vitD3onadhesion、invasionandmigrationofPGCL3cellsweredeterminedusinganalysisofadhesion-relatedbasementmembranecomponentsfibronectinandlaminin，reconstitutedbasementmembraneinvasionassay，andTranswellmodel，1，252vitD3displayedgrowthinhibitoryactivityagainstPGCL3cellswithIC50valuesofμmol/Lfor24hoursoftreatment.，andμmol/Lof1，25-dihydroxyvitaminD3inhibitedPGCL3cellstoinvadethereconstitutedbasementmembraneby%，%，%，anddecreasedthepercentagesoflocomotionandmigrationofPGCL3cellsby%，%，%.Inaddition，1，25-dihydroxyvitaminD3inhibitedPGCL3cellstoadheretothebasementmembranecomponentsfibronectinand1，25-dihydroxyvitaminD3cansignificantlyinhibittheadhesion，invasionandmigrationofPGCL3cells，andthesuppressionofadhesionofPGCL3cellstofibronectinandlamininmayberesponsiblefortheinhibitionofadhesionandinvasionofPGCL3cells.

【Keywords】1，25-dihydroxyvitaminD3;adhesion;invasion;migration;PGCL3cells

侵襲和轉(zhuǎn)移是不斷改進(jìn)性腫瘤最重要的惡性行為和治療的主要障礙，是臨床90%以上癌癥患者的致死因素，因此，控制侵襲和轉(zhuǎn)移成為惡性腫瘤患者預(yù)后的關(guān)鍵因素，研發(fā)具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移的新藥有著十分重要的意義。

1，25羥化維生素D3又名骨化三醇，是維生素D在肝臟和腎臟羥化酶的作用下最終被轉(zhuǎn)化為其活性形式。近幾年來(lái)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響備受關(guān)注。骨化三醇對(duì)體外培養(yǎng)的幾乎所有類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞有抑制或促分化作用，并且能夠抑制、殺死或預(yù)防體內(nèi)多種腫瘤［1～5］。但其對(duì)腫瘤的作用機(jī)制尚未完全明確，最近的研究結(jié)果表明骨化三醇的抗腫瘤作用與其抑制

腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲和血管生成相關(guān)。目前，骨化三醇對(duì)人高轉(zhuǎn)移巨細(xì)胞肺癌PGCL3細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響還未見(jiàn)報(bào)道。本文對(duì)骨化三醇對(duì)人PGCL3細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、侵襲、運(yùn)動(dòng)和粘附能力的影響進(jìn)行研究，為將其開(kāi)發(fā)成為有效的臨床抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥提供理論依據(jù)。

1材料與方法

材料與試劑1，252VitD3、MTT、纖維粘連蛋白、蘇木精、伊紅、優(yōu)凱特均購(gòu)自Sigma公司；超級(jí)無(wú)支原體新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物材料有限公司；RPMI-1640購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；層粘連蛋白購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理系；胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Transwell室購(gòu)自美國(guó)Costar公司；聚碳酸酯膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；膠原購(gòu)自華美生物工程公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。人高轉(zhuǎn)移巨細(xì)胞肺癌PGCL3細(xì)胞引自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理系。

方法

細(xì)胞培養(yǎng)PGCL3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清，100ku/L青霉素和100mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

MTT法檢測(cè)骨化三醇對(duì)PGCL3細(xì)胞生長(zhǎng)的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96孔板，每孔接種100μl。培養(yǎng)過(guò)夜后，吸出培養(yǎng)液，加入新培養(yǎng)液90μl，及不同濃度的骨化三醇溶液10μl，使終濃度分別為、、、μmol/L。對(duì)照組則加入相同體積的培養(yǎng)液，每一濃度設(shè)8個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h。每孔加入MTT20μl，培養(yǎng)4～6h。每孔加入三聯(lián)液DMSO100μl。用ELX800型酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)量OD值，以Bliss法計(jì)算半數(shù)抑制濃度。

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)Transwell室朝上室方向的上膜面已鋪好Matrigel，朝下室方向的下膜面涂纖維粘連蛋白10μl，風(fēng)干后放入已含有600μl含%牛血清白蛋白的RPMI-1640培養(yǎng)液的下小室中，37℃孵育1h，取出備用。將經(jīng)、、μmol/L骨化三醇處理24h的PGCL3細(xì)胞重懸于含%BSA的RPMI-1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為×109個(gè)/L，加100μl細(xì)胞懸液于Transwell室的上小室。對(duì)照組為未經(jīng)骨化三醇處理的PGCL3細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)平行孔。在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育6h。取出上小室，甲醇固定3min，蘇木精染色3min，水洗。伊紅染色10s，水洗。擦去上膜面的Matrigel及未穿過(guò)膜的細(xì)胞，優(yōu)凱特膠封片。在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇6個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)。計(jì)算平均值，以穿過(guò)膜的細(xì)胞相對(duì)數(shù)目來(lái)表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。侵襲抑制率=×100%。

細(xì)胞運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)除膜上不涂纖維粘連蛋白外，其余方法步驟同。

細(xì)胞與FN、LN的粘附實(shí)驗(yàn)分別將μgFN、LN鋪于96孔板。用50μl含2%BSA的RPMI-1640培養(yǎng)液封閉1h，PBS洗2次，待用。將經(jīng)、、μmol/L骨化三醇處理24h的PGCL3細(xì)胞重懸于含%BSA的無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為8×108個(gè)/L，每孔加100μl細(xì)胞懸液，對(duì)照組為未經(jīng)骨化三醇處理過(guò)的PGCL3細(xì)胞，每一濃度設(shè)8個(gè)平行孔。37℃孵育1h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入200μl預(yù)熱的PBS洗去未粘附細(xì)胞。每孔加入100μlMTT，調(diào)零孔無(wú)細(xì)胞，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，每孔加入100μlDMSO，用ELX800型酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)量OD值，細(xì)胞粘附率按下式計(jì)算。細(xì)胞粘附率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，結(jié)果用Student′sttest進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果

骨化三醇對(duì)人高轉(zhuǎn)移巨細(xì)胞肺癌PGCL3生長(zhǎng)的抑制作用結(jié)果表明，骨化三醇可明顯抑制PGCL3細(xì)胞的生長(zhǎng)。骨化三醇作用PGCL3細(xì)胞24h的IC50為μmol/L。表1不同濃度骨三醇對(duì)PGCL3的生長(zhǎng)抑制作用

注：與對(duì)照組比較，***P＜

骨化三醇對(duì)PGCL3細(xì)胞侵襲能力的影響經(jīng)骨化三醇、、μmol/L作用24h后，PGCL3細(xì)胞侵襲重組基底膜的能力明顯受到抑制，抑制率分別為%、%、%。表2骨化三醇對(duì)PGCL3細(xì)胞侵襲能力的影響

注：與對(duì)照組比較，*P

骨化三醇對(duì)PGCL3細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響骨化三醇、、μmol/L作用PGCL3細(xì)胞24h后，能抑制PGCL3細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，且呈劑量依賴性，抑制率分別為%、%、%。表3骨化三醇對(duì)PGCL3細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響

注：與對(duì)照組比較，*P

骨化三醇對(duì)PGCL3細(xì)胞與FN、LN粘附能力的影響見(jiàn)圖1。

圖1骨化三醇對(duì)PGCL3細(xì)胞FN、LN粘附能力的影響

由圖1看出、、μmol/L的骨化三醇作用PGCL3細(xì)胞24h后能降低PGCL3細(xì)胞對(duì)基質(zhì)成分LN、FN的粘附率，并呈一定的劑量依賴關(guān)系。

3討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明骨化三醇能明顯抑制PGCL3細(xì)胞生長(zhǎng)，作用PGCL3細(xì)胞24h后的IC50為μmol/L。而抗腫瘤侵襲、運(yùn)動(dòng)和粘附能力的藥物其對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用應(yīng)控制在10%左右，因此，選擇、、μmol/L骨化三醇來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。這三個(gè)濃度的骨化三醇對(duì)PGCL3細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，但經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明可降低PGCL3細(xì)胞的侵襲能力，這說(shuō)明骨化三醇抑制PGCL3細(xì)胞侵襲、粘附和遷移可能與其細(xì)胞毒作用無(wú)直接關(guān)系。

近年來(lái)，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究在細(xì)胞和分子水平上已取得了一不定期的進(jìn)展。Liotta等提出侵襲過(guò)程分為“三步”：粘附、降解基底膜和基質(zhì)運(yùn)動(dòng)。上述三步重復(fù)進(jìn)行，使得腫瘤細(xì)胞向深層侵襲。μmol/L骨化三醇即可明顯抑制PGCL3細(xì)胞侵襲能力和細(xì)胞趨向性運(yùn)動(dòng)能力，并能降低PGCL3細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分FN、LN的粘附。因此，上述幾項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明骨化三醇是通過(guò)抑制細(xì)胞粘附、運(yùn)動(dòng)而抑制PGCL3細(xì)胞的體外侵襲能力的。【參考文獻(xiàn)】

1PourgholamiMH，AkhterJ，LuY，etal.Invitroandinvivoinhibitionoflivercancercellsby1，25-dihydroxyvitaminD3.CancerLett，2000，151:97-102.

2KoshizudaK，KoikeM，AsouH，etal.CombinedeffectofvitaminD3analogsandpaclitaxelinthegrowthofMCF-7breastcancercellsinvivo.BreastCancerResTreat，1999，53:113-120.

3NivY，SperberAD，F(xiàn)igerA，etal.Incolorectalcarcinomapatients，serumvitaminDlevelsvaryaccordinggostageofthecarcinoma.Cancer，1999，86:391-397.

4GrossC，StasmeyT，HancockS，etal.Treatmentofearlyre