生物素親和素系統相關技術指導一、生物素-親和素系統（BAS）一)生物素及活化生物素二)親和素及鏈霉親和素三)-親和素系統的特點生物素親和素系統相關技術指導一）生物素及活化生物素(一)生物素1概念：生物素(biotin)是動、植物體內廣泛分布的一種小分子生長因子，又名輔酶R或維生素H。2.分子式：

C10H16O3N2S分子量：生物素親和素系統相關技術指導3.結構：（CH2）4COOH咪唑酮環噻吩環結合親和素結合蛋白質生物素親和素系統相關技術指導生物素與蛋白質的結合生物素親和素系統相關技術指導

1）生物素分子較小，與蛋白質結合后，由于大分子蛋白質的空間位阻效應，可影響生物素與親和素間的結合；

2）生物素只能依靠肽鍵與蛋白質上的氨基結合。

因此，活化生物素可克服以上缺點，既減少空間位阻效應，又可擴大其結合的對象。(二)活化生物素生物素親和素系統相關技術指導1.標記蛋白質氨基：N-羥基丁二酰亞胺酯（BNHS）、長臂活化生物素（BCNHS）。2.標記蛋白質醛基：酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）。3.標記蛋白質巰基：3-（N-馬來酰亞胺-丙酰）-生物胞素（MPB）。4.標記核酸：光生物素、生物素脫氧核苷三磷酸、BNHS和BHZ。生物素親和素系統相關技術指導1.標記蛋白質氨基：N-羥基丁二酰亞胺酯（BNHS）、長臂活化生物素（BCNHS）。抗體中性和偏堿性蛋白的標記生物素親和素系統相關技術指導2.標記蛋白質醛基：生物素酰肼（BHZ）、肼化生物胞素（BCHZ）用于偏酸性糖蛋白的生物素標記生物素親和素系統相關技術指導標記對象：大分子活性物質：如抗原、抗體。標記后不影響免疫活性。酶：如HRP、葡萄糖氧化酶和ALP等。會降低ALP的活性。(三)生物素標記蛋白質生物素親和素系統相關技術指導活化生物素可與不同的大分子物質結合，應根據可標記基團的種類及特性，選擇相應的活化生物素；抗體：BNHS

偏酸性抗原：BHZ

核酸：光生物素生物素親和素系統相關技術指導一個蛋白質分子可聯結多個生物素分子，即生物素化大分子具有多價性，它是BAS多級放大作用的物質基礎。但每個蛋白質上標記的生物素分子數量應控制在一定范圍。每個抗原標記1-3個生物素分子為宜；每個抗體標記3-5個生物素分子為宜；生物素：IgG(mg/mg)=2:1，效果較好。生物素親和素系統相關技術指導二）親和素和鏈霉親和素(一)親和素(avidin，A)1.概念：是動物微生物中提取的一種含10%碳水化物的堿性糖蛋白。2.分子量：680003.結構：4個相同亞基組成的四聚體糖蛋白，富含色氨酸，它是與生物素結合的基團。生物素親和素系統相關技術指導A4.特性：每個亞基都可結合1個生物素分子，即1個親和素分子可結合4個生物素分子。5.親和常數：1015/mol6.缺點：由于是堿性蛋白（PI=10），且含糖基，與聚苯乙烯的非特異性吸附較高，會導致本底增大，降低檢測靈敏度。生物素親和素系統相關技術指導二）親和素和鏈霉親和素(二)鏈霉親和素(streptavidin，SA)：1.概念：是從鏈球菌屬的菌培養液中提取的一種蛋白質。2.分子量：650003.結構：由4個相同的肽鏈組成，甘氨酸和丙氨酸含量較大。生物素親和素系統相關技術指導4.特性：1個親和素分子可結合4個生物素分子。5.親和常數：1018/mol6.優點：為弱酸性蛋白（），不含糖基，因此與聚苯乙稀的非特異性吸附遠低于親和素，因此應用廣泛。SA生物素親和素系統相關技術指導標記對象：大分子物質：如酶、抗原和抗體。小分子物質：膠體金、FITC和化學發光物等。二）親和素和鏈霉親和素(三)親和素的標記生物素親和素系統相關技術指導三）生物素-親和素系統的特點1.特異性強：

親和素和生物素間的高親和力。2.靈敏度高：

每個親和素分子可與四個生物素結合；生物素化大分子具多價性。3.快速、穩定：4.應用廣泛：可與酶、熒光素、膠體金等多類標記技術結合；生物素親和素系統相關技術指導

可有Ag與Ab反應的各種免疫方法：夾心法、間接法、競爭法等，在此基礎上引入A-B系統。BAB法：BA法：ABC法：二、BAS的基本類型及原理生物素親和素系統相關技術指導BAB法：

Ab·BAAb·B-AB·?Ab·B-A-B·?

特點：以游離A分別連接B-Ab和B-E；

Ab·B和A-B的兩次放大效應，可提高靈敏度。

生物素親和素系統相關技術指導+A+A+BAB法在夾心ELISA中的應用生物素親和素系統相關技術指導BA法：

Ab·BA·?Ab·B-A·?特點：省略加標記生物素步驟，操作較BAB

法簡便；

Ab·B的放大效應，該法有相當高的靈敏度。生物素親和素系統相關技術指導+A-EBA法在間接ELISA中的應用生物素親和素系統相關技術指導ABC法：⑴A+B·?A-B·?----------ABC⑵Ag+Ab·BAg-Ab·BABCAg-Ab·B-ABC特點：是在BAB法基礎上的改良，將BAB法中的A先與B-E結合，制備成復合物ABC；操作比BAB法簡便，但仍然保持較高的靈敏度。生物素親和素系統相關技術指導++ABCB-E+AABCABC法在夾心ELISA中的應用生物素親和素系統相關技術指導1、BAS在酶免疫技術中的應用2、BAS在熒光免疫技術中的應用3、BAS在放射免疫技術中的應用4、BAS在分子生物學中的應用三、生物素-親和素系統的應用生物素親和素系統相關技術指導免疫-PCR

免疫PCR是在ELISA的基礎上建立起來的新方法，用PCR擴增代替ELISA的酶催化底物顯色。

PCR具有很強的放大能力，其可以定量地檢測DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特異性，因此，將與抗原結合的特異抗體通過連接分子與DNA結合，再經PCR擴增，由此定量檢測抗原使敏感性高于ELISA和RIA。生物素親和素系統相關技術指導免疫-PCR一、主要程序1.抗原+生物素化抗體→抗原-生物素化抗體復合物；2.加親合素→抗原-生物素化抗體-親合素復合物；3.加生物素化DNA→抗原-生物素化抗體-親合素-生物素化DNA；4.PCR擴增生物素化DNA部分。生物素親和素系統相關技術指導PCR擴增原理引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退火生物素親和素系統相關技術指導PCR技術具有高度的靈敏性30輪循環擴增量達230個拷貝（