細胞貼壁過程本文檔共44頁；當前第1頁；編輯于星期三\14點54分貼附接觸抑制密度抑制細胞呈貼壁生長,梭形或不規則形,在粘附因子的作用下，細胞生出偽足，偽足越多，貼壁越好。細胞在生長過程中達到相互接觸時停止分裂的現象。因此，貼壁細胞通常都是單層細胞培養狀態。細胞接觸后，雖發生接觸抑制，但只要營養充分，細胞仍會增殖分裂，細胞數量仍在增多。但當細胞密度進一步增大，培養液中營養成分減少，代謝產物增多時，細胞因營養的枯竭和代謝物的影響，則發生密度抑制，導致細胞分裂停止。本文檔共44頁；當前第2頁；編輯于星期三\14點54分粘附型細胞分為：1、成纖維細胞型：似體內成纖維細胞的形態，胞體梭形或不規則三角形，胞質向外伸出2—3個長短不等的突起，中有卵圓形核。生長時排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片，細胞—細胞接觸易斷開而單獨行動，游離的單獨的成纖維樣細胞，常有幾個伸長的細胞突起。2、上皮型細胞：類似體內的上皮細胞，扁平，不規則多角形，中有圓形核。生長時易相連成片，相靠—緊密相連—成薄層—鋪石狀生長時呈膜狀移動，很少脫離細胞群而單個活動。3、游走細胞型：呈散在生長，一般不連成片，胞質常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規則。此型細胞不穩定，有時難以和其他細胞相區別。4、多形型細胞：有一些細胞，如神經細胞難以確定其規律和穩定的形態，可統歸于此類。

本文檔共44頁；當前第3頁；編輯于星期三\14點54分細胞培養的條件1、無菌、無毒：（1）對培養液和所有用具進行無菌處理（2）添加一定量的抗生素，防治培養過程中的污染（3）定期更換培養液，以便清除代謝產物防治細胞代謝產物積累對細胞自身造成危害2、全部的營養物質：葡萄糖、氨基酸、無機鹽、促生長因子、微量元素、動物血清等。3、適宜的溫度和PH值：36.5+0.5度,PH值4、必要的氣體條件：O2

：細胞代謝所必需的CO2：維持培養液的PH通常采用培養皿或松蓋培養瓶將其置于含95%空氣和5%CO2的培養箱中進行培養5、其他：光照、濕度等本文檔共44頁；當前第4頁；編輯于星期三\14點54分細胞培養的方式根據細胞生長方式分為貼壁培養和懸浮培養兩大類；根據細胞代次分為原代培養和傳代培養；根據細胞培養操作方式分為：1、固定化培養：通過一些固相的交聯化合物將細胞固定于小格中，或者通過共價鍵交聯住細胞，在培養基中進行培養。2、分批培養：將細胞和培養基一次性加入反應器內進行培養，此后細胞不斷增長，產物不斷形成和積累，最后將培養基連同細胞一并取出，培養結束。3、流加培養：在分批培養的基礎上間斷地或連續地補加培養基。4、半連續培養：當細胞和培養基一起加入反應器后，在細胞增長和產物形成過程中，每間隔一段時間，取出部分培養物或細胞，然后補充同樣數量的新鮮培養基，繼續培養。5、連續培養：連續性加入新鮮的培養基，同時取出相同量的舊培養基和細胞。6、灌流培養：當細胞和培養基一起加入反應器后，在細胞增長和產物形成過程中，不斷地將部分條件培養基取出，同時不斷地補充新鮮培養基。通常用于被固定后的細胞培養。本文檔共44頁；當前第5頁；編輯于星期三\14點54分原代培養：從機體取出后立即培養的細胞為原代細胞。培養的第1代細胞與傳10代以內的細胞稱為原代細胞培養。傳代培養：將原代細胞從培養瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養瓶中繼續培養，稱為傳代培養。特殊的概念：永生化細胞：正常細胞的生長代謝處于增殖、分化、衰老及凋亡的動態平衡，體外增殖是有限的，培養細胞生命的自然極限稱為海弗利克極限。細胞內控制這一系列過程的是一個龐大復雜的細胞調節網絡，其中任何一個環節發生錯誤，都有可能觸發細胞內相互關聯的一系列信號分子的表達和功能異常，使細胞跨越海弗利克極限，獲得不死性，發生永生化。細胞系：指原代細胞培養物經首次傳代成功后所繁殖的細胞群體。無限細胞系：細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系，也稱連續細胞系。有限細胞系：初代培養物開始第一次傳代培養后的細胞系的生存期限有限，為有限細胞系。原代培養和傳代培養本文檔共44頁；當前第6頁；編輯于星期三\14點54分細胞懸液10代細胞50代細胞無限傳代原代培養傳代培養原代培養和傳代培養多數組織細胞固定在表面生長和分裂。隨細胞增多，細胞就會停止分裂增殖遺傳物質改變遺傳物質未改變人工誘導癌化本文檔共44頁；當前第7頁；編輯于星期三\14點54分細胞傳代及培養方法本文檔共44頁；當前第8頁；編輯于星期三\14點54分取動物組織塊用胰蛋白酶處理分散成單個細胞通常選用幼齡動物組織或胚胎細胞（細胞分化程度低，增殖能力強，更易于培養）動物貼壁細胞培養過程本文檔共44頁；當前第9頁；編輯于星期三\14點54分1、棄掉培養瓶中的培養液；2、加入0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準），靜置2-10min（顯微鏡下動態監測）。3、吸去胰蛋白酶液，加入一定量的培養液(以能覆蓋整個瓶底為準）。4、用吸管吸取瓶內培養液，反復吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液。5、吸取細胞懸液，300g離心2-5min，用新鮮的培養基重懸制備細胞懸液；6、分瓶接種于新的培養瓶內，加適量新鮮培養液。7、培養箱中培養。貼壁細胞傳代培養方法-胰酶消化法胰蛋白酶的消化功能：胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應不一樣。胰酶分散細胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關，在pH為8.0、溫度為37℃時，胰酶溶液的作用能力最強。使用胰酶時，應把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷。本文檔共44頁；當前第10頁；編輯于星期三\14點54分植物懸浮細胞培養過程本文檔共44頁；當前第11頁；編輯于星期三\14點54分1懸浮生長細胞傳代：離心法傳代：離心（300-500g/min）去上清，沉淀物加新培養液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。2半懸浮生長細胞傳代（Hela細胞）：此類細胞部分呈現貼壁生長現象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。懸浮型細胞傳代培養方法-離心法本文檔共44頁；當前第12頁；編輯于星期三\14點54分植物組織培養和動物細胞培養的比較比較項目植物組織培養動物細胞培養原理細胞的全能性細胞增殖培養基性質固體培養基液體培養基培養基特有成分蔗糖、植物激素葡萄糖、動物血清培養結果完整的植物體細胞群體培養目的快速繁殖、培育無病毒植株等獲得細胞或細胞分泌蛋白等本文檔共44頁；當前第13頁；編輯于星期三\14點54分正常細胞生命期是指細胞在培養中持續增殖和生長的時間，包括原代培養期、傳代培養期及衰退期。1、原代期：也稱初代培養，即從體內取出組織接種培養到第一次傳代階段，一般持續1-4周。細胞呈活躍移動，可見細胞分裂，但不旺盛。與體內原組織在形態結構和功能活動上相似性大。2、傳代期：體內細胞生長在動態平衡環境中，生存空間和營養是有限的。當細胞增殖達到一定密度后，則需要分離出一部分細胞和更新營養液，否則將影響細胞的繼續生存，這一過程叫傳代。傳代期在細胞全生命期中的持續時間最長，細胞增殖旺盛。3、衰退期：此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。本文檔共44頁；當前第14頁；編輯于星期三\14點54分體外培養細胞“一代”生存期細胞“一代”系指從細胞接種到分離再培養時的一段時間，這已成為培養工作中的一種習慣說法，它與細胞世代或倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代或倍增不同；在細胞一代中，細胞能倍增3～6次。細胞“一代”生存期包含潛伏期、指數增生期、停滯期和衰退期。本文檔共44頁；當前第15頁；編輯于星期三\14點54分1、潛伏期（1）游離：懸浮，胞質回縮,全部細胞變為圓球形，約10分鐘至4小時。（2）吸附：貼附底物，一般24小時內貼壁，細胞株平均在10分鐘至4小時后貼壁。（3）潛伏：可有運動活動，基本無增殖,少見分裂相，一般為6～24小時。2．指數增生期細胞增值最旺盛的階段，細胞分裂相增多，群體均一是理想的實驗用細胞。指數增生期細胞分裂相數量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志。指數增長期末期會出現接觸抑制和密度抑制現象。3．停滯期細胞數量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。細胞數量不再增加，故也稱平臺期（Plateau）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養液中營養漸趨耗盡，代謝產物積累、pH降低。此時需做分離培養即傳代，否則細胞會中毒，發生形態改變，重則從底物脫落死亡。本文檔共44頁；當前第16頁；編輯于星期三\14點54分潛伏期指數生長期停滯期本文檔共44頁；當前第17頁；編輯于星期三\14點54分影響潛伏期長短的因素：1、細胞種類傳代培養的細胞之潛伏期比原代培養的細胞短。傳代培養期的細胞6-24h，原代24-96h或更長。連續細胞系(6-24h)比有限細胞系與正常細胞系的潛伏期短。2、接種的細胞密度密度越大、數量越多，細胞群體越容易適應體外環境，潛伏期就短。相反，即便是在很小的培養空間內，如接種的細胞數量不夠大，潛伏期仍會較長3、培養條件培養液、pH、底物、污染,有毒

本文檔共44頁；當前第18頁；編輯于星期三\14點54分誘導轉化有限系無限系本文檔共44頁；當前第19頁；編輯于星期三\14點54分練習：動物細胞培養與植物細胞培養的重要區別在于（）

A.培養基不同；

B.動物細胞培養不需要在無菌條件下進行；

C.動物細胞可以傳代培養，而植物細胞不能；

D.動物細胞能夠大量培養，而植物細胞只能培養成植株。作業：1、原代培養與傳代培養的區別？2、傳代培養細胞的特點？3、簡述動物細胞培養過程？4、動物細胞培養的條件？5、離體培養的動物細胞分為那些類型及各自特點？本文檔共44頁；當前第20頁；編輯于星期三\14點54分第四節細胞代謝與調控1、糖代謝與脂肪代謝的相互關系2、糖代謝與蛋白質代謝的相互關系3、脂肪代謝與蛋白質代謝的相互關系4、核酸和其他物質代謝的相互關系本文檔共44頁；當前第21頁；編輯于星期三\14點54分一、糖代謝與脂肪代謝的相互關系延胡索酸琥珀酸蘋果酸草酰乙酸3-磷酸甘油三羧酸循環甘油乙酰CoA三酰甘油脂肪酸

糖原（或淀粉）1，6-二磷酸果糖磷酸二羥丙酮磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸合成植物或微生物特有氧化糖異生糖酵解乙醛酸循環本文檔共44頁；當前第22頁；編輯于星期三\14點54分二、糖代謝與蛋白質代謝的相互關系草酰乙酸乙酰CoA檸檬酸α-酮戊二酸

糖原（或淀粉）1，6-二磷酸果糖磷酸二羥丙酮磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸糖酵解甘油丙氨酸天冬氨酸谷氨酸脫氨基琥珀酸乙醛酸途徑三羧酸途徑糖異生本文檔共44頁；當前第23頁；編輯于星期三\14點54分三、脂肪代謝與蛋白質代謝的相互關系氨基酸碳架氨基酸3-磷酸甘油甘油乙酰CoA三酰甘油脂肪酸合成氧化磷酸二羥丙酮磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸本文檔共44頁；當前第24頁；編輯于星期三\14點54分四、核酸和其他物質代謝的相互關系甘氨酸天冬氨酸谷氨酰胺一碳單位合成嘌呤合成嘧啶核酸核苷酸ATPGTPCTPUTP磷酸核糖ADP+GiGDP+GiCDP+GiUDP+Gi雙糖或多糖磷酸戊糖途徑葡萄糖能量和磷酸基團的供應單糖的轉變和多糖的合成參與卵磷脂的合成給蛋白質合成提供能量本文檔共44頁；當前第25頁；編輯于星期三\14點54分代謝調控總論代謝調節的三級水平：細胞/酶水平調節激素水平調節神經水平調節多細胞整體水平調節代謝物通過影響細胞內酶活力和酶合成量的變化，改變合成或分解代謝過程的速度內分泌腺所分泌的激素通過體液輸送到一定組織，作用于靶細胞，改變酶活性而調節代謝反應的方向和速度。CNS的控制下，通過神經遞質對效應器發生直接影響，或者改變激素的分泌。本文檔共44頁；當前第26頁；編輯于星期三\14點54分酶水平調節酶活性調節（酶結構調節）變（別）構調節快速調節（微調）酶合成的誘導與阻遏長期調節（粗調節）酶含量調節（基因表達水平調節）化學修飾調節酶的降解細胞/酶水平調節本文檔共44頁；當前第27頁；編輯于星期三\14點54分酶活性調節---變構調節別構效應物別構激活劑——別構激活（正反饋）——增加活性別構抑制劑——別構抑制（負反饋）——降低活性某些代謝物能與變構酶分子上的變構部位特異性結合，使酶的分子構象發生改變，從而改變酶的催化活性以及代謝反應的速度。被調節的酶稱為變構酶或別構酶使酶發生變構效應的物質，稱為變構效應劑。其中引起酶活性增加的變構效應劑成為變構激活劑；引起酶活性降低的變構效應劑稱為變構抑制劑。本文檔共44頁；當前第28頁；編輯于星期三\14點54分變構調節的生理意義1、代謝終產物反饋抑制反應途徑中的酶，使代謝物不致生成過多。乙酰CoA乙酰CoA羧化酶丙二酰CoA長鏈脂酰CoA2、變構調節使能量得以有效利用，不致浪費。3、變構調節使不同的代謝途徑相互協調。G-6-P糖原磷酸化酶抑制糖的氧化糖原合酶促進糖的儲存檸檬酸6-磷酸果糖激酶抑制糖的氧化乙酰輔酶A羧化酶促進脂酸合成本文檔共44頁；當前第29頁；編輯于星期三\14點54分本文檔共44頁；當前第30頁；編輯于星期三\14點54分酶活性調節---共價修飾調節酶蛋白肽鏈上某些殘基在酶的催化下發生可逆的共價修飾，從而引起酶活性改變，這種調節稱為酶的共價修飾。共價修飾的主要方式：1、磷酸化---去磷酸2、乙?；?--脫乙酰3、甲基化---去甲基4、腺苷化---脫腺苷5、單價巰基---二硫鍵-OHThrSerTyr酶蛋白H2OPi磷蛋白磷酸酶ATPADP蛋白激酶ThrSerTyr-O-PO32-磷酸化的酶蛋白共價修飾的特點：1、酶蛋白的共價修飾是可逆的酶促反應，在不同酶的作用下，酶蛋白的活性狀態可互相轉變。2、具有放大效應，效率較變構調節高。3、磷酸化與脫磷酸是最常見的方式。4、同一個酶可以同時受變構調節和化學修飾調節。本文檔共44頁；當前第31頁；編輯于星期三\14點54分本文檔共44頁；當前第32頁；編輯于星期三\14點54分酶含量調節-酶合成的誘導、阻礙和降解DNA轉錄初產物RNAmRNA蛋白質前體mRNA降解物活性蛋白質DNA水平調節轉錄水平調節轉錄后加工的調節翻譯調節mRNA降解調節翻譯后加工的調節核細胞質DNA水平的調控轉錄水平的調控轉錄后水平的調控翻譯水平的調控翻譯后水平的調控本文檔共44頁；當前第33頁；編輯于星期三\14點54分舉例：乳糖對乳糖操縱子的表達的影響①沒有乳糖存在時，lac操縱子不表達mRNAproteinIDNAZYAOPpol阻遏基因②有乳糖存在時，lac操縱子基因表達mRNAproteinIDNAZYAOPpol本文檔共44頁；當前第34頁；編輯于星期三\14點54分激素水平調節高等生物內分泌腺分泌的激素通過體液轉運到靶細胞而對代謝進行調節。激素激素激素靶細胞受體細胞內信號跨膜傳遞細胞內的化學反應生物學效應按激素受體在細胞的部位不同，可將激素分為兩大類：1.膜受體激素：膜受體是存在于細胞表面質膜上的跨膜糖蛋白。2.胞內受體激素：大多數位于細胞核內，有的在胞液中的特異受體結合蛋白。第一信使受體信號第二信使，產生級聯方法效應。本文檔共44頁；當前第35頁；編輯于星期三\14點54分本文檔共44頁；當前第36頁；編輯于星期三\14點54分

E0E1En-1+或-反饋+或-正作用：凡反應物能使代謝過程速度加快者稱為正作用。負作用：凡反應物能使代謝過程速度變慢者稱為負作用。代謝調控的基本類型前饋S0S1S2Sn1、前饋作用（feedforward）：在代謝途徑中前面的底物對其后某一催化反應的調節酶有作用。分為前饋激活和前饋抑制，相當于前饋正作用和前饋負作用。2、反饋作用（feedback）：代謝產物對前面的某一酶有作用。分為反饋激活和反饋抑制，相當于反饋正作用和反饋負作用。本文檔共44頁；當前第37頁；編輯于星期三\14點54分

丙酮酸激酶前饋激活乙酰CoA羧化酶前饋抑制1、前饋作用G6-P-G6-P-F1,6-2P-F磷酸烯醇丙酮酸(PEP)丙酮酸(1)前饋激活（feedforwardactivation）(2)前饋抑制(feedforwardinhibition)乙酰CoA+CO2+H2O+ATP丙二酸單酰CoA+ADP+Pi本文檔共44頁；當前第38頁；編輯于星期三\14點54分E1E2E3E4反饋抑制2.反饋作用（1）一價或單價反饋抑制，即直線式反饋控制，只有一個末端代謝產物的途徑。ABCDPE1E2E3E4反饋抑制ABCDP本文檔共44頁；當前第39頁；編輯于星期三\14點54分b.協同反饋控制：分支代謝過程中，任何終產物都不能單獨地反饋該途徑，而當所有終產物都過剩時才能協同地反饋控制該途徑。E1E2E3XYABCDE4E5（2）二價或多